L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare lo sviluppo di neurosfere da neuroni ippocampali e corticali primari misti isolati dall'embrione di ratto E14-E16 Sprague Dawley, al fine di offrire una piattaforma robusta e a basso costo per studiare l'effetto di vari cavi neuroterapici. Come sapete, quel cervello è una complessa rete di neuroni associati a un gran numero di cellule di supporto. Per comprendere la funzione cerebrale, spesso la maggior parte della ricerca viene riavvolta da esperimenti in vitro, che coinvolgono linee cellulari derivate dal lignaggio neurale disponibili in commercio.
Tuttavia, queste linee cellulari sono linee cellulari trasformate che soffrono di variazioni genotipiche e fenotipiche. Per affrontare questi problemi, la cultura primaria dei neuroni è l'approccio adatto. Qui, abbiamo illustrato un protocollo semplice ed economico per la cultura dei neuroni primari e costruito una solida piattaforma di screening per varie terapie neurali.
Il vantaggio principale di questo protocollo è che semplicemente modulando le densità di placcatura cellulare, possiamo mostrare due piattaforme di coltura neuronale contrastanti in cui la bassa densità porta a una prolungata coltura primaria dei neuroni, e l'alta densità genera neurosfere spontanee. Prendi due piatti da 24 pozzi. Uno per l'alta densità e l'altro per la placcatura a bassa densità.
Trasferire 12 mm di coverlips in vetro sterile nelle piastre da 24 pozzi. Versare 300 microlitri di soluzione PDL in ciascuno dei pozzi in modo che copra completamente la superficie dell'intero coverslip. Preparare la soluzione PDL ad una concentrazione di 0,1 mg/mL in acqua deionizzata.
Avvolgere le piastre con fogli di alluminio per evitare l'asciugatura e tenerlo nell'incubatore di CO2 durante la notte. Il giorno dopo, prima della placcatura, aspirare la soluzione PDL. Lavare correttamente con acqua sterile per due o tre volte.
Quindi aggiungere i supporti di placcatura e riportare le piastre all'incubatrice fino alla placcatura. Sacrifica un topo Sprague-Dawley incinta a tempo E14-E16, fai un taglio a forma di V nella zona addominale usando forcep sterili e un paio di forbici contundenti. Rimuovere tutti i feti e posizionarli con cura sulla piastra di petri con soluzione HBSS fredda.
Eseminare gli embrioni dalle sacche embrionali e lavarli accuratamente in una piastra di Petri separata in HBSS fresco e freddo. Decapitare la testa con l'aiuto di forbici sterili. Trasferire le teste nelle piastre di petri sterili da 90 mm con HBSS freddo.
Al microscopio stereo, tenere la testa dalla regione del muso con le forcep seghettate sterili e eserti il cervello tagliando la pelle e il cranio aperti. Rimuovere tutte le meningi dagli emisferi e dal cervello intermedio tenendo il tronco encefalico. Rimuovere con cura gli emisferi intatti, simili a tappi di funghi che contengono l'ippocampo e la corteccia.
Raccogliere gli emisferi contenenti corteccia e ippocampo intatto in un tubo conico da 15 ml contenente 10 ml di mezzi di dissociazione. Permettere ai tessuti raccolti di depositarsi e aspirare il mezzo di dissociazione, lasciando in esso dal 5 al 10% del mezzo. Ancora una volta, aggiungere 10 mL di mezzo di dissociazione fresco e ripetere questo passaggio due volte.
Aggiungere 4,5 mL di mezzo di dissociazione e 0,5 mL di soluzione di tripina-EDTA. Tienilo nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 20 minuti affinché la digestione proceda. Aspirare il mezzo e lavare con 10 mL di mezzo di dissociazione e mezzo di placcatura, consecutivamente.
Resuspend loro in 2,5 mL di mezzo di placcatura. Conservare un piatto sterile da 90 mm sul coperchio invertito del piatto e versarlo nella base di un piatto sterile da 90 mm. Titolare i tessuti digeriti nella base d'angolo del piatto, utilizzando la punta della pipetta da 1000 microlitri, in modo da occupare il minor volume.
Passare la sospensione cellulare ottenuta attraverso il filtro cellulare da 70 micrometri, esclusi eventuali pezzi di tessuto. Determinare la densità delle celle vitali utilizzando l'esclusione del colorante blu trypan e contare il numero di celle in un contatore di celle automatizzato. Diluire il numero di cellule ottenute in modo da 1,5 a 10 alla potenza di 5 celle per ml per la placcatura ad alta densità e di 20.000 celle per ml per la placcatura a bassa densità in due tubi separati contenenti 30 ml di mezzo di placcatura.
Aspirare il mezzo di placcatura precedentemente aggiunto e la piastra 500 microlitri di cellule disperse in mezzo di placcatura in ogni pozzo. Successivamente, riportare le piastre nell'incubatrice per quattro ore. Quattro ore dopo la placcatura, esaminare le cellule per l'aderenza al microscopio.
Dopo quattro ore di placcatura, sia nelle placche ad alta che in bassa densità, i neuroni mostrano una buona aderenza alle placche. Sostituire il mezzo in ogni pozzo con 500 microlitri di mezzo di manutenzione fresco e incubarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dobbiamo colturare questi neuroni placcati ad alta e bassa densità.
Mentre i neuroni placcati a bassa densità possono essere utilizzati per colture prolungate, fino a 30 giorni, cambiando il mezzo di manutenzione due volte a settimana, i neuroni placcati ad alta densità iniziano a generare spontaneamente neurosfere, che sono arrivate il giorno dopo che abbiamo mantenuto in una piastra di attacco ultra-bassa. Dopo 24 ore di placcatura, si osservano sia neuroni placcati ad alta che a bassa densità per mostrare una morfologia sana. Qui viene visualizzata un'immagine a contrasto di fase dei neuroni placcati a bassa densità, coltivati per circa sette giorni.
I neuroni mostrano una morfologia sana e possono essere mantenuti fino a 30 giorni con instradamenti e interconnessioni più vigorosi. Il diagramma a barre mostra circa il 90% di vitalità dei neuroni placcati a bassa densità anche dopo 30 giorni di coltura, come determinato dal saggio MTT. I neuroni primari qui sono stati caratterizzati dall'immunostaining con Tuj 1, un marcatore di neuroni differenziati, e tau, un marcatore di assoni neuronali.
La purezza dei neuroni è confermata dall'assenza di colorazione nei marcatori non neuronali GFAP per gli astrociti e O4 per gli oligodendrociti. In tutti gli studi di caratterizzazione, i nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Qui, le cellule sementi a bassa densità sono state macchiate con marcatore astrocitico GFAP e marcatore neuronale Tuj 1 per controllare la purezza della coltura fino a sette giorni.
Si osserva che questo protocollo supporta la crescita preferenziale dei neuroni rispetto agli astrociti come indicato attraverso l'analisi quantitativa. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Allo stesso modo, nelle cellule sementi ad alta densità, gli astrociti sono stati macchiati con GFAP e neuroni da Tuj 1.
Qui, nell'analisi quantitativa, si osservano circa il 17% di astrociti rispetto all'83% dei neuroni. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Dopo sette giorni, si osservano neurosfere multiple formate spontaneamente nei neuroni ad alta densità.
Intorno all'ottavo-decimo giorno di coltura, nei neuroni placcati ad alta densità, le neurosfere iniziano a formare grandi proiezioni e ponti costituiti da estensioni radiali simili a gliali. Le frecce nere indicano il ponte tra due nevrosfere di nuova formazione. Il test delle cellule vive e morte è stato eseguito sulle neurosfere per 15 giorni.
Nella colorazione densa di Calcein AM, senza alcuna colorazione di ioduro propidio, indica quasi il 100% di vitalità delle neurosfere in coltura. Il grafico a linee qui indica un'espansione delle dimensioni delle neurosfere con il passare del numero di giorni. Questa immagine esentemente macchiata della neurosfera indica una ricca popolazione di cellule progenitrici neurali attraverso una maggiore espressione dei marcatori NPC Nestin e Tuj 1.
Le neurosfere qui mostrano elevate quantità di astrociti segnati dalla forte espressione di GFAP, accompagnati da un'espressione ancora più alta del marcatore neuronale Tuj 1. I nuclei sono stati macchiati con Hoechst 33258. Quindi penso che il nostro protocollo sia piuttosto eccitante e interessante, considerando il fatto che da una singola strategia siamo in grado di ottenere due piattaforme: una 2D e una 3D.
E questa sarà un'ottima piattaforma per lo screening di diverse tracce neuroterapeutiche. Quindi credo che sia davvero utile a tutti i neuroscienziati. Un altro aspetto importante è che le neurosfere in cui optiamo sono estremamente ricche di cellule progenitrici neurali, i PNG.
E possono essere usati per differenziarli in neuroni e lignaggi non neuronali. Quindi, sento che se, davvero, le persone possono padroneggiare questa tecnica prendendo aiuto da questo video, sarà davvero utile per tutti. Grazie.
