Name: dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling
Uploaded: 2017-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling at JoVE.com

MAK riconosce il supporto per questo lavoro dai National Institutes of Health / numero - 1R15CA152985-01A1 di sovvenzione del National Cancer Institute. Questo progetto è stato supportato anche dal Miami University Undergraduate Research Award programma, le opportunità di dottorato-laurea Università di Miami per Scholarship Program e il programma di studiosi di Miami University estivo.

le procedure effettuate nel video e descritti di seguito sono state approvate da istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) presso l'Università di Miami.
 1. preparazione e Test di stimolo <ol><li>stabilire due aree distinte per la procedura chirurgica, il tavolo operatorio e la tabella post-operazione. Fase di entrambe le aree con tutti i materiali e gli utensili necessari.
	Tabella <ol><li>stage operativo sotto un cappuccio ventilato. Organizzare la tabella con l'apparecchiatura in un modo che permette il continua e senza ostacoli delle prestazioni della procedura.</li>
		<li>Stabilire una tabella di postoperatoria nella stessa stanza e vicino al tavolo principale dell'operazione. Mantenere entrambe le tabelle come ambienti sterili durante tutta la procedura.</li>
	</ol></li> <li>Posto i seguenti rifornimenti sul tavolo operatorio: un barattolo con coperchio, una provetta da 15 mL, un paio di forbici chirurgiche, una bottiglia di etanolo al 70%, due pannelli in schiuma, due pinze, due siringhe di calibro 1 mL 21, due provette da 50 mL, una provetta , un flaconcino criogenico, quattro rilievi chirurgici, dieci birilli, un dispenser di salviette sterilizzanti e un contenitore di sharps.</li>
	<li>Posto le seguenti forniture sul tavolo post-operazione: una bilancia analitica, uno 4 L dewar di azoto liquido, una vasta poco profonda bocca dewar, un rack di Conetti galleggiante, un paio di forbici chirurgiche, due pinze, quattro fiale criogeniche e un dispenser di salviette sterili.</li>
	<li>Riempire un 50 mL e un tubo da 15 mL 75% volume con formalina.</li>
	<li>Con uno spillo in ogni angolo, apporre un tampone chirurgico ad un Consiglio di schiuma approssimativo 30 x 30 cm per servire come il bordo di dissezione. Utilizzare i rimanenti quattro perni durante l'operazione. Preparare un piccolo bordo di schiuma con un tampone chirurgico per trasferire gli organi alla tabella post-op. 
	Attenzione: Isoflurano (99.9%) è una sostanza chimica tossica e deve essere utilizzato in una cappa di sfiato per garantire il massimo livello di sicurezza dall'evacuazione di gas anestetico dei rifiuti 8. Ulteriori informazioni riguardanti i rischi per i ricercatori associati all'utilizzo del metodo open-goccia con isoflurano possono essere trovate in un articolo di Taylor e Mook 8.</li>
	<li>Inserire un tampone chirurgico il vaso di vetro e bagnare con qualche goccia di isoflurane (99.9%) e posizionare un asciugamano di carta sopra la parte superiore per evitare il contatto diretto del mouse con l'isoflurano. Analogamente, utilizzare un tampone chirurgico per linea tubo restante e bagnare con qualche goccia di isoflurano e posizionare un cuscinetto supplementare sopra la parte superiore per evitare il contatto diretto tra il mouse e l'isoflurano.</li>
	<li>Pour azoto liquido in bocca ampia superficiale dewar fino alla linea di riempimento massimo è raggiunto.</li>
	<li>Posto il mouse selezionato per dissezione in anestesia da camera, cioè il vaso di vetro con un tampone imbevuto con poche gocce di isoflurane (99.9%) coperta con il coperchio, per un minimo di ~ 1 
	Nota: Questo tempo varia da mouse a mouse. Una volta che il mouse è incosciente, rimuoverlo dall'alloggiamento e posizionarlo al centro del tavolo operativo.</li>
	<li>Orientare il mouse in modo che si è sdraiato sul lato ventrale e con la testa puntato lontano dallo scienziato. Posizionare la testa all'interno del tubo interno foderato con un tampone chirurgico imbevuto con qualche goccia di isoflurane (99.9%) e un pizzico di piede per assicurare che il mouse non risponde agli stimoli per eseguire un test di stimolo.
	<ol><li>Se questo test ha esito negativo e il mouse risponde alla prova di pizzico del piede, ripetere il passaggio 1.8.</li>
	</ol></li></ol> 2. Incisione, cuore di puntura e l'eutanasia iniziale <ol><li>Pin gli arti del mouse alla scheda di schiuma chirurgica e bagnato il lato ventrale del mouse con etanolo al 70%.</li>
	<li>Pizzicare la pelle/pelliccia vicino all'apertura uretra con pinze e tirare leggermente verso l'alto. Fare un'incisione con le forbici chirurgiche attraverso la cavità addominale, a partire dall'apertura uretra, la linea mediana e termina al mento.
	<ol><li>Vicino al punto di partenza dell'incisione iniziale, afferrare un lato della pelliccia/pelle con il forcipe e fare un'altra incisione con le forbici verso il basso e in diagonale verso la zampa posteriore.</li>
		<li>Ripetere questa operazione nello stesso modo sul lato opposto. 
		Nota: La pelliccia/pelle può essere appuntata giù per creare una più ampia apertura, ma non è necessaria.</li>
	</ol></li> <li>Cuore di individuare e rimuovere il pericardio, che è la sacca intorno al cuore, per evitare l'intasamento dell'ago della siringa.
	<ol><li>Afferrare il pericardio con il forcipe e tagliare con le forbici. Eseguire la puntura di cuore inserendo con attenzione l'ago della siringa nel cuore pulsante e iniziare lentamente per ritrarre lo stantuffo.</li>
		<li>Per la raccolta del sangue ottimale, usare lo stantuffo dell'ago per imitare l'azione di pompaggio del cuore ed evitare di disegno troppo in fretta. 
		Nota: In genere circa 1 mL di sangue può essere raccolto.</li>
		<li>Dopo aver completato la raccolta di sangue, dissipare il sangue nella provetta da centrifuga e smaltire la siringa nel contenitore di sharps.</li>
		<li>Dopo la puntura di cuore viene eseguita, eseguire l'eutanasia rimuovendo gli allegati collegamento cuore. 
		Nota: L'eparina, un anticoagulante, non è stato aggiunto alla siringa in questa procedura prima della puntura cuore per permettere al sangue di coagulare per raccolta del siero in questo studio specifico. Tuttavia, se il ricercatore ha desiderato impedire la coagulazione del sangue per la raccolta del plasma, l'eparina potrebbe aggiungersi alla siringa prima della puntura di cuore.</li>
	</ol></li> <li>Se lo studio comporta la genotipizzazione del mouse, praticare una porzione dell'orecchio con le forbici e inserire in una provetta da centrifuga per una verifica di genotipo.</li></ol>
 3. pancreas estrazione <ol><li>Locate stomaco sul lato sinistro del mouse. Begin delicatamente (in modo da evitare di strappare) che separa il pancreas dallo stomaco e duodeno utilizzando due pinze. 
	Nota: Prima di scollegare il pancreas dallo stomaco e l'intestino, è molto importante che le pinze sono utilizzate delicatamente per guidare il tessuto pancreatico lontano gli organi e a non schiacciare o strappare il pancreas con il forcipe.
	<ol><li>Continuano a separare il pancreas dalle sezioni piccolo intestino digiuno e ileo e infine dall'intestino cieco dell'intestino crasso.</li>
	</ol></li> <li>In intestino cieco, riposizionare il forcipe e continuare la separazione del pancreas lungo il restante colon verso il retto. 
	Nota: A questo punto, è conveniente tagliare e rimuovere la parte dallo stomaco alla regione del colon immediatamente precedente retto.</li>
	<li>Individuare il pancreas e attaccato la milza. Far scorrere il pancreas verso il lato destro del mouse. Separare le connessioni rimanenti tra il pancreas e la cavità toracica con il forcipe per scollegare completamente il pancreas e la milza comunicanti.</li>
	<li>Rimuovere il pancreas e stenderlo per esame. Lasciare la milza associata al pancreas per scopi di identificazione.
	<ol><li>Rimuovi tutto del tessuto connettivo, il tessuto grasso e mesenterico dal pancreas. 
		Nota: Questo tessuto è più bianco nel colore e quindi può essere facilmente distinto dal tessuto del pancreas che è pinker in colore. Ciò è particolarmente importante se l'intero pancreas deve essere rimosso. Ad esempio, se il pancreas deve essere pesato e rispetto al peso corporeo o tra gruppi di animali. Nel Ptf1a cre / +; LSL-Kras G12D / + modello del topo, in particolare nei mesi precedenti, tessuto pancreatico fibroso duro potrebbe essere presente. In questo caso, la rimozione accurata del pancreas dovrà svolgersi come l'intestino potrebbe essere intrecciata nel tessuto del tumore. Nei casi avanzati, possono anche essere presenti anormale della milza e tessuto del fegato.</li>
	</ol></li> <li>Se lo si desidera, rimuovere altri organi a questo punto.</li></ol>
 4. raccolta dei dati e archiviazione <ol><li>dopo l'estrazione degli organi, spostare i campioni alla zona postoperatoria per conservazione.</li>
	<li>Pesare ogni organo e metterli nel loro rispettivo flacone criogenico. 
	Nota: lungo with la massa di ciascun campione, eventuali irregolarità devono essere registrate per riferimento futuro.</li>
	<li>Una volta che gli organi sono pesati, inserirli nell'azoto liquido per congelamento snap.</li>
	<li>Dopo lo snap di congelamento, riporre gli organi a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Il formalina memorizzato i campioni sulla parte superiore del banco durante la notte e la mattina successiva modificare loro soluzione da formalina in etanolo al 70%. 
	Nota: Questi campioni devono essere conservati a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
	<li>Per immagazzinaggio a lungo termine, congelare il pugno di sangue e l'orecchio a-80 ° C.. Per la raccolta del siero dal sangue, permettere al sangue di coagulare per 30 min e poi centrifugare esso. Rimuovere la parte di siero utilizzando una pipetta e quindi conservare a -80 ° C.</li>
</ol> 5. Clean Up <ol><li>Sanitize tutti la dissezione strumenti con le salviettine sterilizzante. Tappo del tubo interno foderato con l'isoflurano imbevuto chirurgiche pad. Sostituire il tampone chirurgico sulla scheda di schiuma con un tampone chirurgico fresco. Disporre le porzioni del mouse che non sono state raccolte per l'alloggio &#39; politica di smaltimento animale s.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+Survival+by+Histologic+Type+of+Pancreatic+Cancer.">Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).</li><li>Jackson-Grusby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+cancer+in+mice.">Modeling cancer in mice.</a> Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).</li><li>Heid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+requirement+of+Rac1+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).</li><li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinvasive+and+invasive+ductal+pancreatic+cancer+and+its+early+detection+in+the+mouse.">Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse.</a> Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAS2+Mutations+in+Human+Pancreatic+Acinar-Ductal+Metaplastic+Lesions+Are+Limited+to+Those+with+PanIN+Implications+for+the+Human+Pancreatic+Cancer+Cell+of+Origin.">KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin.</a> Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).</li><li>LaConti, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbic+System+Participates+in+Mediating+the+Effects+of+General+Anesthetics.">Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).</li><li>Ijichi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggressive+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice+caused+by+pancreas-specific+blockade+of+transforming+growth+factor-&#946;+signaling+in+cooperation+with+active+Kras+expression.">Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-&#946; signaling in cooperation with active Kras expression.</a> Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).</li><li>Abiatari, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin-dependent+cytoskeleton+remodelling+is+associated+with+an+anaplastic+phenotype+of+pancreatic+cancer.">Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).</li><li>Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Statistical+significance+analysis+of+nuclear+magnetic+resonance-based+metabonomics+data.">a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data.</a> Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).</li><li>Yadav, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+Tumefactive+Chronic+Pancreatitis:+Clinical+Profile,+Histology,+and+Natural+History+After+Resection.">Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Significato per quanto riguarda i metodi esistenti Mentre esista altri video informale delle dissezioni del mouse, questo video articolo fornisce la prima qualità professionale, inter pares, dimostrazione visiva di tutti i passaggi dettagliati necessari per l'estrazione e la raccolta del pancreas del mouse tramite la dissezione10 . Il pancreas è un organo principale per attività metabolica e insulino produzione, la dissezione e la raccolta del pancreas permette la conservazi...

Il mouse è emersa come un importante modello animale di cancro del pancreas umano1,2. Nel Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + modello del topo, Kristen oncogene di ratto sarcoma (K-Ras) viene attivata esclusivamente nel pancreas, con conseguente apertura di lesioni precancerose del pancreas, conosciuto come neoplasia intraepiteliale pancreatica (PanINs), che il progresso per gli adenocarcinomi duttali pancreatici, comunemente come PDACs3. Questo sistema di modello del mouse fornisce uno dei migliori modelli animali disponibili per cancro del pancreas umano4,5, con l'ulteriore vantaggio che il PanINs emergono entro i primi cinque mesi di vita e frequentemente di progresso per PDAC entro un singolo anno4,5, considerando che il cancro del pancreas si verifica più frequentemente negli esseri umani 60-70 anni di età.
Estrazione del pancreas tramite la dissezione dal Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / + topi alle varie età permette per un esame istologico longitudinale dello sviluppo del cancro del pancreas, che vanno dalle prime fasi PanIN attraverso la progressione a PDAC3,4 , 5. raccolta del pancreas alle età che variano da cinque a quindici mesi può essere utilizzata anche per preparare il tessuto estratti per caratterizzare i cambiamenti globali nel pancreas4 metabolismo che si verificano durante la transizione da sano al tessuto malato 6,7.
Questo articolo presenta una guida visiva completa i passaggi necessari per eseguire un'estrazione del pancreas del mouse e fornisce linee guida per la conservazione di un pancreas per ulteriori analisi. Questa guida sarà altrettanto preziosa per individui conducendo una ricerca su altre malattie del pancreas, compreso il diabete di tipo e dovrebbero essere particolarmente utili per gli studenti e gli investigatori nuovi di ricerca che coinvolge la raccolta del pancreas del mouse utilizzando dissezione per profiling metabolico o analisi istologiche.

<table><tbody><tr><td>Glass Jar&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3140-150</td><td>The glass jar used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>Lid of Glass Jar</td><td>Corning</td><td>9985-150</td><td>The glass jar lid used in the video has been discontinued.&amp;nbsp; This is its replacement.</td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>9201</td><td></td></tr><tr><td>Squeeze bottle&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-409-10DD</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-684</td><td></td></tr><tr><td>Foam Boards</td><td>Therapak</td><td>562908</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>200205SHN</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 21G Syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>309624</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-258</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Pads</td><td>Fisher Scientific</td><td>S67011</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins Length:&amp;nbsp; 2&quot;&amp;nbsp;</td><td>Advance Store Products</td><td>X32T-05</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizing Wipes</td><td>Professional Disposables International Inc.</td><td>Q85084</td><td></td></tr><tr><td>Sharps Container</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-827-122</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Marshall Scientific</td><td>ME-AE200</td><td></td></tr><tr><td>4L Dewar</td><td>Taylor-Wharton</td><td>4LD</td><td></td></tr><tr><td>Shallow Wide Mouth Dewar</td><td>Fisher Scientific</td><td>F3087-V</td><td></td></tr><tr><td>Floating Microtube Rack</td><td>VWR</td><td>60986-100</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vial 1.2 mL, Sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-25</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)&amp;nbsp;</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td>Wright Brothers</td><td>NIT-60-XX</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Kras Strain</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>OO8179</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Cre Strain</td><td>MMRRC</td><td>OOO435-UNC</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling

Stiamo indagando il fattore di trascrizione specifico del pancreas, 1a cre-ricombinasi; ratto di salmone affumicato-fermata-salmone affumicato-Kristen sarcoma, glicina, l'acido aspartico pone al codone 12 (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) ceppo il mouse come un modello di cancro del pancreas umano. L'obiettivo dei nostri studi attuale consiste nell'identificare nuovi biomarcatori metabolici della progressione del cancro del pancreas. Abbiamo eseguito il profilo metabolico di urina, feci, sangue ed estratti di tessuto del pancreas, come pure le analisi istologiche del pancreas per mettere in scena la progressione del cancro. Il pancreas del mouse non è un organo solido ben definito come negli esseri umani, ma piuttosto è un tessuto molle diffusamente distribuito che non è facilmente identificabile da parte di persone non hanno familiarità con l'anatomia interna del mouse o da individui che hanno poca o nessuna esperienza di prestazione dissezioni di organo del mouse. Lo scopo di questo articolo è quello di fornire una dettagliata graduale dimostrazione visiva per guidare i novizi nella rimozione del pancreas del mouse tramite la dissezione. Questo articolo dovrebbe essere particolarmente utile per gli studenti e gli investigatori di nuovo alla ricerca che richiede la raccolta del pancreas del mouse tramite la dissezione per profiling metabolico o analisi istologiche.

La figura 1 Mostra una panoramica dell'area ambiente operativa e la figura 2 Mostra l'area di operazione post. Mentre questa impostazione fornisce la quantità minima di attrezzature e messa in scena, gli individui possono scegliere di modificare questo per meglio soddisfare le esigenze individuali. Il protocollo dovrebbe essere ottimizzato secondo le specifiche esigenze dell'esperimento. Questa procedura è condotta in modo che ...

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Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Questo video articolo fornisce una dimostrazione dettagliata delle procedure necessarie per rimuovere con successo il pancreas da un mouse tramite la dissezione per l'analisi istologica e profiling metabolico.

Dissezione del Pancreas del Mouse per l'analisi istologica e Profiling metabolico

We have been investigating the pancreas specific transcription factor, 1a cre-recombinase; lox-stop-lox- Kristen rat sarcoma, glycine to aspartic acid at ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

36.5K Views.  Miami University. Questo video articolo fornisce una dimostrazione dettagliata delle procedure necessarie per rimuovere con successo il pancreas da un mouse tramite la dissezione per l'analisi istologica e profiling metabolico.

Video: Dissection of the Mouse Pancreas for Histological Analysis and Metabolic Profiling

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

Che imita e manipolare Metaplasia acinoso--Ductal pancreatico nella coltura cellulare 3-dimensionale

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

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The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Here, we describe a method for the isolation of cells in the pancreas microenvironment from embryonic, neonatal and adult mouse tissue, focusing on the isolation of mesenchymal cells. This method allows profiling of cell gene expression and protein secretion in order to elucidate the extrinsic signals that regulate pancreas development, function, and tumorigenesis.

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Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic beta-cell proliferation and islet growth is particularly challenging. We have developed a method to capture the distribution of beta-cells in the intact pancreas of transgenic mice with fluorescence-tagged beta-cells with a macro written for ImageJ (rsb.info.nih.gov/ij/). Following pancreatic dissection and tissue clearing, the entire pancreas is captured as a virtual slice, after which the GFP-tagged beta-cells are examined. The analysis includes the quantification of total beta-cell area, islet number and size distribution with reference to specific parameters and locations for each islet and for small clusters of beta-cells. The entire distribution of islets can be plotted in three dimensions, and the information from the distribution on the size and shape of each islet allows a quantitative and qualitative comparison of changes in overall beta-cell area at a glance.

In situ Quantification of Pancreatic Beta-cell Mass in Mice

The following protocol outlines the process of pancreatic dissection for virtual slice imaging, and the subsequent quantification of all GFP-tagged beta-cells in the entire pancreas.

Quantificazione in situ di cellule beta pancreatiche Messa in topi

Tracing changes of specific cell populations in health and disease is an important goal of biomedical research. The process of monitoring pancreatic ...

Biologia

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Medicina

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Immunologia e infezioni

A Mouse Model for Chronic Pancreatitis via Bile Duct TNBS Infusion

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. Several rodent models have been developed to study CP, of which the bile duct 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) infusion model replicates the features of neuropathic pain seen in CP. However, bile duct drug infusion in mice is technically challenging. This protocol demonstrates the procedure of bile duct TNBS infusion for generation of a CP mouse model. TNBS was infused into the pancreas through the ampulla of Vater in the duodenum. This protocol optimized drug volume, surgical techniques, and drug handling during the procedure. TNBS-treated mice showed features of CP as reflected by bodyweight and pancreas weight reductions, changes in pain-associated behaviors, and abnormal pancreatic morphology. With these improvements, mortality associated with TNBS injection was minimal. This procedure is not only critical in generating pancreatic disease models but is also useful in local pancreatic drug delivery.

Chronic pancreatitis (CP) is a disease characterized by inflammation and fibrosis of the pancreas, often associated with intractable abdominal pain. This article focuses on refining the technique to generate a mouse model of CP via bile duct infusion with 2,4,6 -trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS).

Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare

Chronic pancreatitis (CP) is a complex disease involving pancreatic inflammation and fibrosis, glandular atrophy, abdominal pain and other symptoms. ...

Acinar-to-Ductal Metaplasia Induction: A Method to Study Acinar Cell to Ductal Cell Differentiation in 3D Ex Vivo Culture

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. <a href="https://www.jove.com/v/59096/" target="_blank">Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of differentiating pancreatic acinar cells to ductal cells in ex vivo 3D culture. This helps to understand the mechanisms regulating the acinar-to-ductal metaplasia (ADM), a key process in the early development of pancreatic cancer.

Induzione della metaplasia acina-duttale: un metodo per studiare la differenziazione da cellula acinara a cellula duttale in coltura 3D ex vivo

Source: Fleming Martinez, A. K. et. al. Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture. J. Vis. Exp. ...