Gli autori riconoscono Anne Charrié presso il servizio Radiobiology (ospedale Lyon-Sud) e il Fond National Suisse (FNS) per il loro sostegno finanziario.

1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e delle soluzioni <ol><li> Preparazione di supporti di coltura <ol><li> Preparare il medium di proliferazione (PM) completando il mezzo F-10 di Ham con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale), 2% fetale calf serum (FCS) e 2% siero sostituto. </li><li> Preparare il mezzo di differenziazione (DM) integrando Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale) e 2% FCS. </li></ol></li><li> Preparazione di soluzioni di assorbimento di glucosio Attenzione: La manipolazione del materiale radioattivo è consentita solo da un personale autorizzato in una zona limitata e controllata. Il materiale e gli sprechi devono essere trattati secondo procedure, linee guida e legislazioni locali appropriate. <ol><li> Per preparare la soluzione salina fosforata (X-DPBS) di X-Dulbecco, preparare una soluzione di DPBS contenente 0,2% (w / v) (concentrazione finale)Umina (BSA). Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 ° C. </li><li> Per preparare una soluzione fredda di 2-deossi-D-glucosio (2dG), pesare 16,4 mg di 2dG e solubilizzare in 10 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione di 10 mM. Conservare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 600 μl di freddo 2dG e 6 μL di radiolabeled [3H] 2dG a 5400 μL di X-DPBS per ottenere la soluzione radiomarcata 2dG (2dG *). NOTA: La concentrazione finale è di 1 mM 2dG e l&#39;etichettatura è 1 μCi / mL. <ol><li> Impostare una aliquota di 20 μl (TC20) di soluzione 2dG * radiomarcato. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione delle miscele di incubazione <ol><li> Per la miscela di citocalasin B aggiungere 2 μL di 20 mM di citocalasin B a 2 ml di soluzione 2dG * radiolabeled. NOTA: La soluzione di base del citocalasin B è a 10 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Per la miscela DMSO aggiungere 4 μL di DMSO alle restanti 4 mL di soluzione 2dG * radiolabeled. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Cultura di cellule muscolari primarie umane <ol><li> Seminazione di piatti a 6 pozzetti con cellule umane del muscolo cellulare NOTA: utilizzare in-house (vedere il riferimento 24 per i dettagli) o le cellule umane del muscolo umano commercialmente disponibili da una fiala congelata (contenente 250.000 celle). La seguente procedura è fornita per 250.000 celle per ottenere una piastra a 6 pozzetti necessaria per la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio in una sola condizione. <ol><li> Rapidamente scongelare flaconi congelati di preparazioni in-house 24 o preparazioni commerciali di cellule umane del muscolo cellulare in acqua pre-riscaldata (37 ° C) fino a quando rimane solo un piccolo blocco di ghiaccio nella fiala. </li><li> Versare direttamente in un tubo di plastica da 50 ml contenente 10 ml di PM pre-riscaldato (37 ° C). </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e scartare il surnatante. </li><li> Riposare delicatamente il pellet cellulare con 18 ml di PM pre-riscaldato (per ottenere 42.000 cellule per3 ml di media). Distribuire 3 mL in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (9,6 cm2). NOTA: i sei singoli pozzetti di una piastra sono necessari per eseguire una misura duplicata di assorbimento di glucosio per le seguenti condizioni: inibizione del trasporto passivo (pozzetti 1 e 2), tasso basale (pozzetti 3 e 4) e tasso stimolato da insulina (pozzetti 5 e 6). Ripetere quanti piatti a sei pozzetti, come sono necessari trattamenti distinti. </li><li> Incubare in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%. NOTA: Questo passaggio richiede tra 48 e 72 h a seconda del batch della cella. Non cambia mezzo durante questo passaggio. </li></ol></li><li> Differenziazione delle cellule muscolari <ol><li> Rimuovere PM (dopo 48-72 h) e sostituire con DM pre-riscaldato (3 mL per pozzetto). Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 . NOTA: La differenziazione richiede cinque giorni per raggiungere uno stato stabile dove le celle sono allineate e polinucleate. Tipicamente, il primarioI miotubi vengono coltivati ​​in un mezzo di glucosio da 1 g / l. Pertanto, per evitare l&#39;esaurimento del glucosio durante la coltura, riempire la piastra con mezzo di 3 ml per assicurare che in qualsiasi momento sia disponibile il substrato di glucosio sufficiente per le cellule. </li><li> Sostituire il mezzo DM ogni due giorni. NOTA: Da questo punto, i myotubes sono stabili per un massimo di 7 giorni senza alcuna modifica significativa e la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio può essere eseguita in qualsiasi momento. </li></ol></li><li> Trattamento delle cellule muscolari (opzionale) NOTA: i miotubi primari possono essere trattati per diversi giorni per indurre la modifica (test di farmaco, inibitori / attivatori del percorso di segnalazione, ecc. ) Prima della stimolazione dell&#39;insulina e delle misure di assorbimento del glucosio. Le cellule muscolari possono essere sottoposte a qualsiasi trattamento che possa avere un impatto sulla sensibilità all&#39;insulina e la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio quantificerà tale impatto. Ad esempio, l&#39;incubazione delle cellule muscolari con il palmitato acido grasso saturo promuove la resistenza all&#39;insulina e le cellule presentano ridottiNsulin stimolava l&#39;assorbimento di glucosio. <ol><li> Preparare 12 ml di DM completato con 10% BSA (senza acidi grassi) e 0,5 ml di palmitato (PALM). Preparare solo 12 ml di DM completato con 10% BSA (solo acido grasso). </li><li> Preparare due piastre a 6 pozzetti con miotubi primari umani e coltivarli come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2 (con 5 giorni di differenziazione). </li><li> Il giorno 5, lavare ogni pozzetto con 2 ml di PBS. Ad una piastra aggiungere 2 mL di DM contenente PALM. All&#39;altra piastra aggiungere 2 mL di BSA contenente solo DM. </li><li> Incubare per 48 h a 37 ° C, 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 3. Stimolazione dell&#39;insulina <ol><li> Lavare le cellule muscolari differenziate due volte con 2 mL di PBS. </li><li> Rimuovere attentamente PBS e incubare con 3 ml di DM senza FCS per 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ) per l&#39;esaurimento del siero. </li><li> Sostituire i supporti in tutti i pozzetti con 3 mL di DM senza FCS. Aggiungere 100 nM insulina ai pozzetti 5 e 6. </li><li> Incubare la cultura umana di myotubes per1 h (37 ° C, 5% CO 2 ). </li></ol> 4. Assorbimento di glucosio <ol><li> Dopo 1 ora di stimolazione dell&#39;insulina, lavare i pozzetti due volte con X-DPBS (1 mL per lavaggio). </li><li> Aggiungere 1 mL di miscela di citocalasin B ai pozzi 1 e 2 e 1 mL di miscela DMSO ai pozzetti 3 - 6. Incubare per 15 minuti (37 ° C, 5% CO 2 ). Al termine dell&#39;incubazione, posizionare immediatamente la lastra sul ghiaccio. </li></ol> 5. Lysis cellulare <ol><li> Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS a ghiaccio freddo. </li><li> Lyse le cellule in ciascun pozzetto con 600 μL di 50 mM NaOH. Incubare su ghiaccio per 5 minuti e mescolare delicatamente con rotazione orbitale lenta. NOTA: Se il lisato è troppo viscoso, diluire fino a 1,5 mL di NaOH. </li><li> Usando una pipetta, risospendere e raccogliere il lisato cellulare. </li></ol> 6. Determinazione del glucosio radioattivato <ol><li> Mettere 400 μl di ciascuna cellula lisata in una fiala di conteggio liquido di scintillazione. Preparare una fiala di controllo negativa con 400ΜL di 50 mM NaOH e un flaconcino di controllo positivo con 20 μL di TC20 (dal punto 1.2.3.1). </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione di scintillazione liquida a ciascuna fiala. Chiudere il tappo e mescolare bene ogni fiala (1-2 s). </li><li> Inserire ciascuna fiala in un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività secondo le istruzioni del produttore. Conteggio record per min (CPM) per ogni fiala di scintillazione per 10 min. NOTA: CPM = &quot;disintegrazioni al minuto&quot; x &quot;efficienza di conteggio&quot;. </li></ol> 7. Tasso di assorbimento di glucosio <ol><li> Utilizzare il restante lisato (200 μL dalla fase 5.2) per misurare la concentrazione proteica. Determinare la concentrazione proteica di ogni lisi cellulare utilizzando Bradford 25 o un metodo equivalente. Calcolare la quantità totale di proteine ​​(Q) in mg per ogni pozzetto. </li><li> Per ottenere TC1 (il valore per 1 μL di radiodiffusione 2dG *), dividere il valore CPM di TC20 per 20. </li><li> Per ogni fiala, calcolare tTasso di assorbimento di glucosio come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOTA: R è misurato in pmol / mg / min. Il mezzo di R per i pozzi 1 - 2 fornisce un tasso di trasporto passivo, R p . Il mezzo di R per i pozzi 3-4 fornisce il tasso di trasporto totale basale, R bt . Il mezzo di R per i pozzi 5-6 fornisce il tasso di trasporto totale stimolato dall&#39;insulina, R it . <ol><li> Calcolare il tasso di trasporto attivo basale (R ba ) come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> Calcolare il tasso di trasporto attivo stimolato dall&#39;insulina (R ia ) come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOTA: nelle cellule reattive dell&#39;insulina come i myotubes, i tassi di assorbimento del glucosio sono di solito rappresentati da tre valori: R ba , R ia , e la stimolazione di insulina piega come R ia / R ba . </li></ol></li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;assorbimento di glucosio è una misura biologica chiave per l&#39;attivazione di attivatori o inibitori sulla coltura cellulare e su come influenzano l&#39;uso del glucosio e la capacità della cellula di rispondere all&#39;insulina. Il metodo descritto qui è stato dimostrato rapido e affidabile ed è stato ampiamente utilizzato in molti studi utilizzando miotubi primari da soggetti sani e / o pazienti affetti da metabolismo 6 , 7 , <sup class=...

Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all&#39;omeostasi del glucosio. Questo tessuto sensibile all&#39;insulina è il sito primario dell&#39;assorbimento di glucosio che è innescato dalla stimolazione insulinica 1 . Nel diabete di tipo 2, la resistenza all&#39;insulina è osservata in diversi tessuti, inclusi i muscoli scheletrici, e conduce alla normale concentrazione di glucosio nel sangue. Pertanto, è di grande importanza determinare il livello di sensibilità all&#39;insulina di questo tessuto e delle sue cellule, se si vuole caratterizzare un difetto di un soggetto o per valutare l&#39;efficacia di un trattamento che intende migliorare. Nei soggetti umani o animali, la tecnica del gold standard per valutare la sensibilità all&#39;insulina è il morsetto iperinsulinemico euglicemico. Introdotto da DeFronzo nel 1979 2 e modificato dal 3 , 4 poi, il metodo permette di quantificare il corpo intero aNd la reattività dell&#39;insulina misurata come il tasso di glucosio da perfezionare sotto la stimolazione dell&#39;insulina per mantenere la concentrazione normale di glucosio nel sangue. L&#39;esplorazione di sensibilità all&#39;insulina può essere eseguita anche a livello cellulare utilizzando modelli muscolari in vitro e la misurazione dei tassi di assorbimento di glucosio rimane uno strumento efficace e affidabile per quantificare la risposta biologica della cellula alla stimolazione insulinica 5 , 6 , 7 . Infatti, la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio quantifica la risposta biologica cellulare alla stimolazione dell&#39;insulina, dal legame dell&#39;insulina al suo recettore alla traslocazione delle vescicole arricchite GLUT4, e che comprende le cascate intracellulari di segnalazione e di fosforilazione 8 . Questo è di grande interesse per i campioni umani, in quanto i miotubi differenziati mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, incluso il metabolismoI disturbi osservati nel paziente 9 , 10 , 11 , 12 . I myotubes mostrano somiglianze strutturali, metaboliche e fenotipiche al muscolo scheletrico 13 , 14 , compresa l&#39;espressione dei trasportatori di glucosio 15 e delle macchine di segnalazione di insulina cellulare 16 . Pertanto, la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio nei miotubi primari è rilevante per caratterizzare il fenotipo muscolare di un donatore, o per indagare l&#39;effetto di un intervento (farmaco, nutrizione o attività fisica) sulla sensibilità dell&#39;insulina nella cellula muscolare. La misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio sui miotubi coltivati ​​è anche uno strumento affidabile quando si eseguono esperimenti che modificano la sensibilità all&#39;insulina 17 , 18 . L&#39; in vitro </Em&gt; è adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero migliorare la reattività all&#39;insulina o potrebbero impedire o invertire la resistenza all&#39;insulina acquisita o indotta dalla 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Qui descriviamo un protocollo dettagliato per coltivare e differenziare i miotubi umani e per misurare i tassi di assorbimento di glucosio cellulare. Il metodo è applicabile a qualsiasi sorgente di cellule umane di precursori muscolari, siano essi provenienti da preparazioni in laboratorio, collaborazioni o fornitori disponibili in commercio. Le linee di cellule muscolari immortalizzate, come C2C12 e L6, rispettivamente dall&#39;origine del topo e del ratto, possono anche essere utilizzate per la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio con questo protocollo 7 . Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi in stati basali e stimolati da insulina usando radiodiffatti [ 3 H] 2dG. TL&#39;uso di un analogo glucosio etichettato consente una accurata determinazione dell&#39;ingresso di glucosio con un materiale di partenza ridotto, una condizione comune quando si lavora con le cellule primarie. La molecola di glucosio modificata non è in grado di entrare nei percorsi metabolici e quindi si accumula all&#39;interno della cellula, consentendo una quantificazione affidabile tramite la radioattività totale della cellula. Le condizioni sperimentali includono l&#39;uso di un inibitore del trasporto di glucosio (citocalasin B) e le misurazioni vengono eseguite con e senza insulina. Questa combinazione permette di determinare le percentuali di ingresso attive del glucosio, nonché il calcolo del cambiamento di piega per l&#39;indice di risposta dell&#39;insulina. Il metodo viene presentato con una dose di insulina durante un solo periodo di incubazione, ma il protocollo può essere facilmente modificato per la risposta alla dose o per gli esperimenti del corso di tempo 12 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="868">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:180px;">In house preparation from human skeletal muscle biopsies</td>
			<td style="width:257px;">If not available, use commercial source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Human primary muscle cell</td>
			<td style="width:171px;">Promocell</td>
			<td>C-12530</td>
			<td style="width:257px;">Should be cultured with associated media C23060 and C23061</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">6-well plate</td>
			<td style="width:171px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">356400</td>
			<td style="width:257px;">BioCoat Collagen I Multiwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Ham&#39;s F10</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0145-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Glutamine</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">X0551-100</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">penicilin/streptomycin 100x</td>
			<td style="width:171px;">Thermo fisher scientific</td>
			<td style="width:180px;">15140122</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Serum substitute UltroserG</td>
			<td style="width:171px;">Pall France</td>
			<td style="width:180px;">15950.017</td>
			<td style="width:257px;">serum substitute in text</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">DMEM low glucose</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0064-500</td>
			<td style="width:257px;">1 g/l glucose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:171px;">Eurobio</td>
			<td style="width:180px;">CVFSVF00-01</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:171px;">Dutscher</td>
			<td style="width:180px;">L0625-500</td>
			<td style="width:257px;">Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Insulin solution human</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">I9278</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">D6134</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Albumin bovine</td>
			<td style="width:171px;">euromedex</td>
			<td style="width:180px;">04-100-812-E</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">fatty acid-free BSA</td>
			<td style="width:171px;">Roche</td>
			<td style="width:180px;">10,775,835,001</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">palmitate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">P0500</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">NET328A001MC</td>
			<td style="width:257px;">Specific Activity: 5-10Ci (185-370GBq)/mmol, 1mCi (37MBq</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:171px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:180px;">c2743</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PICO PRIAS VIAL 6ml</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">6000192</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">ultima gold MW CA&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td>6013159</td>
			<td style="width:257px;">scintillation liquid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:261px;">b&#234;ta counter&#160;</td>
			<td style="width:171px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:180px;">2900TR</td>
			<td style="width:257px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

glucose uptake measurement and response to insulin stimulation in in vitro cultured human primary myotubes

Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all&#39;omeostasi del glucosio. La valutazione della sensibilità all&#39;insulina delle cellule muscolari è di grande rilevanza per tutti gli studi dedicati all&#39;esplorazione del metabolismo muscolare del glucosio e alla caratterizzazione delle alterazioni metaboliche. Nelle cellule muscolari, le proteine ​​di glucosio trasportatore di tipo 4 (GLUT4) si traslocano alla membrana plasmatica in risposta all&#39;insulina, consentendo così l&#39;immissione massiccia di glucosio nella cellula. La capacità delle cellule muscolari di rispondere all&#39;insulina aumentando il tasso di assorbimento di glucosio è una delle letture standard per quantificare la sensibilità delle cellule muscolari all&#39;insulina. I miotubi primari umani sono un modello in vitro adatto, in quanto le cellule mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, compresa la sensibilità all&#39;insulina. Questo modello in vitro è anche adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero influenzare la reattività dell&#39;insulina. Riflettere le misurazioni della portata di glucosio in miotubi differenziatiSensibilità all&#39;insulina. In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento di glucosio con e senza stimolazione dell&#39;insulina. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi di trasporto passivi e attivi di glucosio usando [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiolabeled). I metodi di calcolo sono forniti per quantificare i tassi attivi basali e insulino-stimolati, nonché la piega di stimolazione.

Il giorno 3, i mioblasti arrivano a confluenza ( Figura 1A ). I myoblasti in questa fase sono tipicamente mononucleati. La media è stata modificata e il giorno 8, la differenziazione è stata completata ( figura 1B ) (protocollo sezione 2). Dopo 5 giorni di differenziazione, i myotubi sono allineati e tipicamente polinucleati. I miotubi primari umani sono stati sottoposti a un trattamento con palmitato o un solo BSA prima della...

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Misurazione dell'assorbimento del glucosio e risposta alla stimolazione dell'insulina in miotubi primari umani coltivati ​​in vitro | Biologia | Video

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento del glucosio. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi negli stati basali e stimolati da insulina utilizzando il [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose radiomarcato.

Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell&#39;insulina in<em&gt; In vitro</em&gt; Myotubes primario umano coltivato

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

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Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

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19.7K Views.  University of Lyon.  In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento del glucosio. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi negli stati basali e stimolati da insulina utilizzando il [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose radiomarcato. 

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Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificazione dei γH2AX Foci in risposta alle radiazioni ionizzanti

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

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Biologia

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

L&#39;insulina per iniezione ed estrazione emolinfa per misurare la sensibilità all&#39;insulina nei adulti Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti<em&gt; In vitro</em&gt; Per identificare i siti di pausa traslazione lungo mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Organelle Trasporti in Colta<em&gt; Drosophila</em&gt; Celle: Cell Line S2 e Primaria neuroni.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA (dsDNA) which has the requisite characteristics to stimulate the cytoplasmic DNA sensing pathways can be generated cheaply and with ease. By the concatemerization of short, synthetic oligonucleotides (which lack CpG motifs), dsDNA can be generated to be of sufficient length to activate the cytosolic DNA sensing pathway. This protocol involves blunt end ligation of the oligonucleotides in the presence of polyethylene glycol (PEG), which provides an environment for efficient ligation to occur. The dsDNA concatemers can be used, following purification by phenol/chloroform extraction, to simulate the innate immune response in vitro by standard transfection protocols. This DNA can also be used to stimulate innate immunity in vivo by intradermal injection into the ear pinna of a mouse, for example. By standardizing the concatemerization process and the subsequent stimulation protocols, a reliable and reproducible activation of the innate immune system can be produced.

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

The aim of the protocol is to use optimal methods for stimulating the cytoplasmic DNA sensing pathways in cells and in vivo. This is achieved by improving the generation of long, double-stranded DNA during blunt-end ligation. Cells or mice are then transfected using a lipid transfection reagent.

La stimolazione dei citoplasmatici DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

Silencing di<em&gt; BRCA2</em&gt; Per identificare le funzioni biologiche Novel BRCA2-regolamentato coltivate cellule umane

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Spazi di giunzione intercellulare di comunicazione: un biomarker funzionale per valutare gli effetti avversi dei tossici e tossine, e benefici per la salute di prodotti naturali

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...