Il modello ex vivo è un metodo utile per valutare l'impatto di vari interventi fisiologici e composti farmacologici e l'assorbimento del glucosio muscolare. Questa tecnica consente la valutazione accurata dell'assorbimento di glucosio nel muscolo scheletrico isolato del topo in assenza di fattori confondenti che possono interferire in un modello animale intatto. Prima di iniziare un esperimento, accendere il sistema di biografia della striscia muscolare integrato e riscaldare le camere a 30 gradi Celsius.
Aprire il software di raccolta dati e calibrare i trasduttori forzati per garantire la comparabilità tra i set di dati. Aggiungere quattro millilitri di mezzo di incubazione basale preriscaldato a 30 gradi Celsius a ciascuna camera di incubazione e assicurarsi che il mezzo sia continuamente ossigenato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica. Posizionare il mouse in posizione prona su un vassoio di dissezione e confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale.
Quindi appuntare una singola zampa anteriore con un ago. Utilizzare le forbici per rimuovere la pelle dalla parte inferiore della gamba fino a quando non sono visibili sia il tendine d'Achille che l'articolazione del ginocchio. Per la dissezione del muscolo soleo, attaccare un singolo anello di sutura di 0,4 centimetri di diametro preparato da un pezzo di sutura chirurgica di nylon non assorbibile di 16 centimetri al tendine di Achille e fissare la pinza di peen al tendine di Achille distalmente al cappio.
Tagliare per rilasciare i muscoli soleo e gastrocnemio dalla zampa e far scorrere con attenzione la pinza del pipì attraverso il topo per esporre il muscolo soleo. Fissare la pinza di peen e posizionare un secondo anello di sutura attorno al tendine prossimale del muscolo soleo. Tagliare il tendine prossimale e sezionare il soleo, compresi i due anelli di sutura attaccati liberi dal muscolo gastrocnemio.
Al momento della raccolta, utilizzare i loop per collegare rapidamente il muscolo soleo ai rispettivi ganci in una delle camere di incubazione. Utilizzare una pinza per rimuovere la fascia che copre il muscolo tibiale anteriore. I tendini distali dei muscoli tibiali anteriori o EDL dovrebbero essere chiari bianchi, visibili e separati l'uno dall'altro.
Tagliare il tendine distillato del muscolo tibiale anteriore e sezionare il muscolo. Utilizzare una pinza per liberare delicatamente il muscolo EDL dai tessuti circostanti, lasciando il muscolo intatto senza tagliare i tendini. Posizionare i singoli anelli di sutura attorno al distillato e ai tendini EDL prossimali.
Quando i loop sono stati posizionati, tagliare i tendini per rilasciare il muscolo EDL con le anse di sutura attaccate e collegare rapidamente le anse ai ganci nella seconda camera di incubazione. Quindi regolare la tensione di riposo di ciascun muscolo a circa cinque millinewton e consentire ai muscoli di equilibrarsi nel mezzo per almeno 10 minuti prima di iniziare l'esperimento. Per misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina, sostituire il mezzo di incubazione basale nelle camere con il mezzo di incubazione senza insulina, una concentrazione di insulina efficace summisionalmente o una concentrazione di insulina massimamente efficace per un'incubazione di 20 minuti.
Alla fine del periodo di stimolazione, sostituire il mezzo di incubazione con un mezzo di incubazione per l'assorbimento del glucosio contenente una concentrazione identica di insulina per un'incubazione di 10 minuti. Alla fine dell'incubazione dell'assorbimento del glucosio, rimuovere con cura i muscoli dalle camere di incubazione e lavare i campioni in un mezzo di incubazione basale ghiacciato. Dopo il lavaggio, asciugare rapidamente i muscoli su carta da filtro e congelare il tessuto senza i loop di sutura in azoto liquido.
Quindi raccogliere 100 microlitri del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera per lo stoccaggio di 20 gradi Celsius e l'analisi dell'assorbimento del glucosio muscolare. Per misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dalla contrazione, posizionare gli elettrodi di platino centralmente e su entrambi i lati dei muscoli all'interno delle camere di incubazione e avviare la contrazione muscolare immediatamente dopo aver sostituito il mezzo di incubazione basale con il mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio. Registrare la produzione forzata da ciascun muscolo incubato.
Dopo 10 minuti, raccogliere e congelare delicatamente i muscoli come dimostrato, immagazzinando 100 aliquote di microlitro del mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio da ciascuna camera per l'analisi dell'assorbimento del glucosio muscolare come dimostrato. Per determinare la segnalazione miocellulare mediante analisi western blotting nello stesso set di campioni muscolari, omogeneizzare ogni campione muscolare congelato in 400 microlitri di tampone di omogeneizzazione ghiacciato e ruotare il campione end over end per un'ora a quattro gradi Celsius. Quindi raccogliere il licato per centrifugalizzazione e misurare la quantità di proteine di interesse all'interno di ciascun pallet campione secondo i protocolli di analisi western blot standard.
Per misurare l'assorbimento di glucosio in ciascun campione, aggiungere 150 microlitri di surnatante da ciascun campione e 25 microlitri di mezzo di incubazione dell'assorbimento del glucosio dalle camere di incubazione corrispondenti per separare i flaconcini di conteggio a scintillazione liquida contenenti tre millilitri di liquido di scintillazione liquida per flaconcino. Quindi caricare i flaconcini su un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività di due deossiglucosio e mannitolo secondo le linee guida del produttore. In questa analisi rappresentativa, i tassi di assorbimento basale del glucosio erano simili tra i muscoli soleo ed EDL isolati dai topi femmina.
L'assorbimento di glucosio è aumentato nei muscoli soleo ed EDL in risposta a concentrazioni di insulina sia submassimali che massimamente efficaci. Inoltre, sia l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina submassimale che quello massimale erano significativamente più alti nel muscolo soleo. Al contrario, l'assorbimento di glucosio indotto dalla contrazione era significativamente più alto nell'EDL rispetto al muscolo soleo.
Qui, si può osservare la forza muscolare massima prodotta nei muscoli soleo ed EDL durante il periodo di stimolazione di 10 minuti. Come previsto, il muscolo EDL ha generato più forza durante la parte iniziale del periodo di stimolazione, seguita da un rapido declino più tardi nel periodo di stimolazione. Le concentrazioni submassimali e massime di insulina hanno indotto un aumento della fosforilazione di Akt treonina 308 e TBC1D4 serina 588, mentre la contrazione ha indotto un aumento della fosforilazione di AMPK Alfa treonina 172 e ACC serina 212.
Né l'insulina né la contrazione hanno portato a un cambiamento nel contenuto proteico totale. Prima di tentare di misurare l'assorbimento del glucosio nei muscoli isolati del topo, è fondamentale praticare a fondo la dissezione dei muscoli soleo ed EDL. Dopo la valutazione dell'assorbimento del glucosio muscolare, il lisato proteico muscolare rimanente può essere utilizzato per ulteriori analisi biochimiche che possono chiarire i cambiamenti osservati nei tassi di assorbimento del glucosio.
