Questa tecnica è significativa perché può misurare l'assorbimento di glucosio in cellule specifiche nei tessuti vivi di Drosophila. Il sensore basato su FRET fornisce una misura diretta delle variazioni dei livelli di glucosio intracellulare. Questa tecnica consente ai ricercatori di valutare i cambiamenti nei livelli di glucosio in tempo reale, all'interno dei motoneuroni viventi dai modelli di SLA rispetto ai controlli.
Un aspetto impegnativo è l'imaging dello stesso insieme di neuroni dopo aver cambiato il buffer. Lasciare il campione sul microscopio aiuta a garantire che il VMC si muova il meno possibile. Prima di iniziare le dissezioni accendere il microscopio di imaging e i laser.
Quindi raccogliere una terza larva instar errante, sciacquarla con acqua doppia distillata e metterla in una goccia di tampone HL3 su un piatto rivestito di elastomero precedentemente preparato. Successivamente, sotto un microscopio sezionante, usa un paio di pinze per fissare le estremità anteriore e posteriore della larva, lato dorsale verso l'alto, allungando attentamente la larva in senso longitudinale con spilli per insetti. Usando un paio di forbici dell'iride angolate, fai un'incisione appena sopra il perno posteriore.
Quindi effettuare un taglio verticale dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva. Dopo aver aggiunto alcune gocce di tampone HL3, se necessario, rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il sistema nervoso centrale. Quindi appuntare i lembi, allungando la parete del corpo per esporre il sistema nervoso centrale mantenendo intatto il sistema neuromuscolare.
Per l'acquisizione di immagini, utilizzare un microscopio confocale verticale con una lente ad immersione in acqua 40 volte. Quindi selezionare il laser a 405 nanometri per eccitare la CFP. Successivamente, ottimizza i parametri di acquisizione come velocità di scansione, media, obiettivo, dimensione del foro stenopeico dello zoom e risoluzione spaziale.
Regolare il guadagno in modo che il segnale sia nella gamma dinamica ottimale e utilizzare gli stessi parametri per tutti i genotipi. Per visualizzare i motoneuroni all'interno del cordone nervoso ventrale, posizionare il piatto di silicone con il campione sezionato sotto la lente e abbassare la lente in modo che entri in contatto con il tampone HL3 di trealosio saccarosio. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer e aggiungere più buffer se necessario. Prossimo.
Utilizzando i canali CFP e FRET, selezionare manualmente una selezione ottica composta da almeno sei motoneuroni a fuoco situati lungo la linea mediana del cordone nervoso ventrale. Quindi acquisire immagini ogni 10 secondi per 10 minuti. Queste immagini rappresentano la linea di base.
Per la stimolazione del glucosio, rimuovere il tampone di trealosio contenente HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere cinque tamponi HL3 integrati con glucosio millimolare senza spostare il cordone nervoso ventrale. Quindi acquisire immagini ogni 10 secondi per altri 10 minuti. Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione.
Salva le immagini come file CZI o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome di file che includa data, background genetico, condizione sperimentale e canali utilizzati. Riutilizzare i parametri per visualizzare tutti i genotipi. Per l'elaborazione delle immagini aprire il software di imaging Fiji-ImageJ, quindi aprire i file CZI, scegliere lo stack di visualizzazione con hyper stack e impostare la modalità colore su scala di grigi e selezionare i canali divisi in finestre separate. Prossimo.
Elabora le immagini utilizzando plug-in di correzione alla deriva, turbo reg e stack reg. Ogni canale viene corretto separatamente selezionando stack reg sotto plug-in e quindi scegliendo la trasformazione in traduzione. Scegli manualmente le regioni di interesse o ROI tracciando tutti i motoneuroni che rimangono a fuoco per l'intera serie temporale.
Quindi utilizzare il ROI manager per salvare ogni contorno del motoneurone. Utilizzare la funzione multi misura per misurare il valore di grigio medio in ciascun ROI in ogni punto temporale. Quindi copiare i ROI tracciati dal primo canale al secondo canale per l'immagine di pre stimolazione.
Per l'analisi dei dati, calcolare il rapporto FRET per CFP utilizzando i valori di grigio medi per i canali FRET e CFP. Le variazioni nei rapporti FRET by CFP riflettono alterazioni nella concentrazione intracellulare di glucosio. Quindi traccia i rapporti FRET per CFP per ogni ROI e punto temporale rispetto al tempo.
Un sensore di glucosio basato su FRET geneticamente codificato è stato utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio nei motoneuroni. Quando il glucosio non è legato al sensore, l'eccitazione CFP causa solo l'emissione di CFP. E quando il glucosio si lega, il segnale YFP può essere rilevato a causa del FRET che si verifica tra CFP e YFP.
Qui sono mostrate immagini dei segnali FRET e CFP nei controlli del sensore di glucosio nei neuroni mutanti TDP-43 in condizioni di base e di stimolazione. Un motoneurone rappresentativo è delineato in ogni immagine come esempio di ROI. Dopo la stimolazione del glucosio, i motoneuroni di controllo che esprimono sensori di glucosio, mostrano un piccolo aumento dell'assorbimento di glucosio mentre i neuroni che esprimono TDP-43 hanno mostrato un assorbimento di glucosio significativamente più elevato.
Ulteriori rapporti FRET by CFP di motoneuroni mutanti TDP-43 sono stati normalizzati ai controlli del sensore di glucosio in ogni punto temporale. In condizioni basali, non c'era differenza tra i genotipi. Tuttavia, dopo la stimolazione del glucosio, è stato osservato un rapido e significativo aumento dell'assorbimento di glucosio nei mutanti TDP-43 rispetto al controllo.
In una rappresentazione a barre, la stimolazione del glucosio nei neuroni che esprimono il sensore di glucosio ha dimostrato un piccolo ma significativo aumento del rapporto FRET per CFP rispetto al basale. Al contrario, i neuroni che esprimono TDP-43 hanno mostrato un aumento significativo del rapporto alla stimolazione rispetto al basale. La differenza netta nei rapporti FRET per CFP tra i motoneuroni che esprimono TDP-43 e il sensore di glucosio è di circa il 10,9% La gestione del tempo è fondamentale per questa procedura in modo che i neuroni non muoiano nel corso dell'imaging.
È importante visualizzare immediatamente dopo le dissezioni per evitare questo. Questa tecnica ha evidenziato l'importanza del metabolismo del glucosio nei neuroni e ha portato il nostro gruppo a studiare ulteriormente il ruolo della glicolisi nella rigenerazione dei motoneuroni.
