L'obiettivo generale di questa procedura di iniezione subretinica è quello di fornire un vettore alla retina in modo minimamente invasivo e riproducibile che sia osservabile in tempo reale. Ciao, questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nella ricerca sulla terapia genica sull'efficacia della consegna vettoriale e sulla tossicità degli agenti terapeutici. Alcuni vantaggi di questa tecnica includono danni minimi alla retina e ad altre strutture oculari, una precisa mappatura del sito di iniezione e rigorose misurazioni quantitative in vivo che consentono una solida inferenza statistica.
Per l'iniezione intraoculare di transgene, posizionare prima un mouse anestetizzato sullo stadio di visualizzazione di un microscopio del sistema di imaging retinico e posizionare le punte di un'iride smussata sterile alle posizioni delle sette e delle 10 della palpebra mentre si spingono le forcep aperte e verso il basso per indurre delicatamente la proptosi. Usa le pinie per convincere le palpebre sotto il globo oculare e dirigere la punta dell'ago a circa uno o 1,5 millimetri sotto il bordo del limbo corneale. Quindi, applicare una goccia di soluzione PBS sterile sull'occhio e coprire l'occhio con un foglietto di copertura sterile.
Guidare con cura l'ago nell'occhio attraverso la congiuntiva fino a quando non viene creata una depressione sclerale. Utilizzare il micro manipolatore per ruotare l'occhio verso l'alto fino a quando la depressione sclerale non è a fuoco, quindi guidare l'ago in avanti per creare un picco acuto nella retina con la punta dell'ago. Utilizzando il supporto dell'ago, ruotare l'ago appena fino a quando la punta dell'ago non porta attraverso la sclera e l'RPE, consentendo alla farina nella punta dell'ago di essere visibile sotto il tessuto retinico nelle immediate vicinanze dello spazio subretinale e del monostrato della cellula dell'epitelio del pigmento retinico.
Guidare la punta dell'ago verso il basso in modo che sia tangenziale al globo, quindi attivare la pompa di iniezione con l'interruttore del pedale. Dopo che 0,5 a un microlitri di soluzione transgena è stato consegnato allo spazio subretinale, ritirare l'ago e confermare che il sangue è stabile e che il fluido non fuoriesce dal sito del tratto di iniezione. Per confermare il successo dell'iniezione, registrare uno Strumento di personalizzazione di Office a volume rettangolare e confrontare le immagini con le immagini dei diversi tipi di potenziali risultati di iniezione.
Dopo la conferma del corretto posizionamento dell'iniezione, utilizzare quell'immagine rettangolare dello Strumento di personalizzazione di Office per mappare l'estensione del bleb sull'immagine del fondo. Per mappare l'estensione del bleb subretinale, aprire un'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office in volume rettangolare del bleb in modo che un punto di riferimento riconoscibile all'interno dell'occhio sia incluso nell'immagine. Aggiungere tutte le pinze necessarie per identificare la posizione dei bordi sinistro e destro della scansione B, così come la testa del nervo ottico, ONH, se presente, e il punto di flessione in cui la retina si stacca dall'RPE e dalla coroide e quindi salvare i dati.
Quindi compilare i file salvati e tracciare i dati, creando in modo efficace una mappa del bleb di iniezione sull'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office. Sovrapporre i dati tracciati all'immagine del fundus contenente il sito di iniezione e salvare l'immagine unita. Utilizzare questa immagine per individuare le aree di interesse durante l'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office di follow-up.
Per valutare la degenerazione retinica post-iniezione, aprire innanzitutto un'immagine del volume rettangolare del dominio spettrale ad alta risoluzione registrata OCT o HRSD OCT e selezionare una scansione B da misurare. Ingrandisci l'immagine selezionata fino a riempire lo schermo e fai clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Fare clic su pinze per selezionare il numero appropriato di pinze, quindi utilizzare la funzione configura pinza per assegnare le pinze come verticali nella colonna del blocco angolare e attivare la posizione della pinza del display per facilitare il posizionamento uniforme della pinza attraverso la retina.
Fare clic su applica e spostare ogni pinza nella posizione appropriata da 0,1 a 0,2 millimetri di distanza attraverso la scansione B, facendo attenzione a posizionare una pinza al centro della testa del nervo ottico quando appropriato. Una volta posizionate tutte le pinze, fare clic e trascinare ogni pinza sull'intervallo di lunghezza della regione di interesse, impostando arbitrariamente le pinze che non sovrappostano le regioni misurabili della scansione B alla lunghezza massima. Per misurare lo spessore dello strato nucleare esterno, posizionare la parte superiore di ogni pinza sulla membrana limitante esterna e la parte inferiore di ogni pinza nella parte inferiore dello strato plexiforme esterno con incrementi da 0,1 a 0,2 millimetri attraverso la retina.
Dopo che tutte le pinze sono state posizionate e regolate in base alle dimensioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e scegliere salva i dati della pinza", quindi ripetere le misurazioni come appena dimostrato per ogni decimo B di scansione, mantenendo le pinze aperte e nella stessa posizione sull'asse x e regolando le lunghezze delle pinze in base alle esigenze, senza spostarle nella direzione x. Una volta misurate tutte le scansioni, aprire i file di dati salvati e fare clic sulla data modificata"per disporre i file in base al tempo risparmiato. Aprire tutti i file per ogni scansione B misurata e compilare i dati non elaborati da ogni scansione B in un unico file dal numero di fotogramma più basso a quello più alto e selezionare le colonne di dati, incluso il nome della pinza, la lunghezza e le colonne X centrale.
Assicurarsi che il centro X sia lo stesso per tutte le scansioni B misurate per ogni immagine dello Strumento di personalizzazione di Office a volume rettangolare elaborata ed eliminare tutti i dati dalle pinze che non sono stati utilizzati per registrare le misurazioni. Impostare la pinza situata al centro della testa del nervo ottico su zero e tracciare i dati per I set di dati X rispetto a più Y per ottenere una funzione di plottaggio 3D per lo spessore dello strato nucleare esterno o di qualsiasi altro strato retinico misurato. Confrontare quindi le misurazioni dello strato nucleare esterno tra il controllo e gli animali da esperimento con le età corrispondenti per determinare la velocità e l'uniformità di qualsiasi potenziale degenerazione retinica.
Per la mappatura 3D delle misurazioni retiniche, rivedere le immagini dello Strumento di personalizzazione di Office post-iniezione e notare eventuali punti di riferimento identificabili, quindi posizionare l'animale per ottenere un'immagine SDO CT di follow-up dalla stessa regione, facendo attenzione a includere gli stessi punti di riferimento identificabili ed elaborare le immagini registrate come appena dimostrato. È molto importante ottenere immagini oct di alta qualità che includano punti di riferimento identificabili per facilitare la rivisitazione delle regioni retiniche precedentemente iniettate. Al fine di misurare i cambiamenti nella lunghezza del sistema operativo, le pinze sono state posizionate dalla membrana limitante esterna alla membrana brooks, consentendo misurazioni affidabili poiché questi strati sono facilmente identificabili nelle immagini oct.
Le differenze nelle misurazioni tra questi strati di diverse linee del mouse sono state attribuite a lunghezze del segmento esterno più brevi. Se l'iniezione subretinale viene eseguita correttamente, l'apertura dello spazio subretinale induce la produzione di un bleb che può essere chiaramente visualizzato sia nella vista en face dell'imager HRSD OCT che nelle immagini di scansione B. La sovrapposizione della mappa di confine del sito di iniezione consente la segmentazione delle misurazioni del tessuto retinico e dei set di dati sulla posizione della pinza per consentire successivi test statistici degli effetti di specifici agenti terapeutici sulla degenerazione retinica.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in dieci minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di mantenere l'ambiente chirurgico pulito e sterile. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della terapia genica per monitorare l'intero processo di iniezione chirurgica subretinica in tempo reale e ha creato un modo per determinare immediatamente il successo chirurgico in vivo.
Seguendo questa procedura di iniezione, oct e altri metodi come l'elettro retinografia possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sul salvataggio funzionale transgene e / o tossicità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come eseguire iniezioni subretiniche transsclerali e transchoroidali, come mappare l'estensione del bleb di iniezione sullo Strumento di personalizzazione di Office da questa immagine e ottenere misurazioni rigorose degli strati retinali esterni. Non dimenticare che lavorare con i vettori di terapia genica può essere pericoloso e che le precauzioni, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati, dovrebbero sempre essere utilizzate durante l'esecuzione di questa procedura.
