Questo studio è supportato dalla Glaucoma Research Foundation Shaffer Grant, dal 4-CA Cavalier Collaborative Award, dalla R01EY029121, dalla R01EY035088 e dalla Knights Templar Eye Foundation.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia e conformi alle linee guida sull'uso degli animali del National Institute of Health (NIH). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.
1. Imaging vis-OCT in vivo 
<ol><li>Il sistema vis-OCT<ol><li>Immagina gli occhi dei topi utilizzando un sistema vis-OCT di piccoli animali che utilizza una sorgente di luce supercontinua, che fornisce un'illuminazione a luce visibile tra 480 nm e 650 nm. Assicurarsi che la potenza incidente sulla cornea sia di 1 mW e utilizzare una velocità della linea A di 25 kHz e un tempo di integrazione di 39,3 μs per linea A.</li>
		<li>Assicurarsi che l'intervallo di rilevamento spettrale dello spettrometro sia compreso tra 508 nm e 613 nm, in modo da ottenere una risoluzione assiale di 1,3 μm nella retina. Il volume totale dell'imaging è di circa 700 μm (x) x 700 μm (y) x 1.500 μm (z). La risoluzione laterale è compresa tra 4,5 μm al centro del campo visivo e 8,7 μm a 350 μm dal centro11,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia per topi<ol><li>Anestetizzare topi di origine C57BL/6 e di entrambi i sessi con un'iniezione intraperitoneale di cocktail di ketamina (114 mg/kg) e xilazina (17 mg/kg) e dilatare le pupille utilizzando gocce di tropicamide all'1%. Confermare un'adeguata anestesia con la perdita del riflesso del pedale dopo un forte pizzicamento del dito del piede.</li>
		<li>Durante l'imaging, tenere il mouse al caldo utilizzando una lampada termica a infrarossi. Dopo ogni acquisizione di immagini, applicare lacrime artificiali per prevenire la disidratazione corneale.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionamento del mouse per l'imaging<ol><li>Posizionare il mouse anestetizzato sul supporto per animali e mantenere il mouse in posizione con l'aiuto di due cinghie in velcro. NOTA: Il supporto per animali consente il movimento in tre dimensioni (regolazione verticale, regolazione orizzontale fine, nonché regolazioni di beccheggio e imbardata) per posizionare il laser nell'occhio del mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Regolazione dei parametri di imaging<ol><li>Accendere il computer e aprire il software di riferimento, che accenderà automaticamente il laser.</li>
		<li>Regolare il supporto per animali fino a quando il laser non è stabile e centrato nell'occhio del mouse. Visualizza la parte posteriore dell'occhio attraverso un'anteprima En Face nell'interfaccia software, il campo visivo (FOV) del plesso vascolare superficiale e un B-scan, la sezione trasversale della retina all'interno del FOV.</li>
		<li>Acquisire un volume vis-OCT facendo clic sul pulsante Acquisisci sull'interfaccia software dopo aver eseguito piccole regolazioni della messa a fuoco ottica, che consiste in 512 linee A/B-scan e 512 B-scan/volume. NOTA: Questo processo richiede ~10.5 s. L'acquisizione delle immagini è guidata da uno stimatore dell'indice di qualità (QI) integrato per garantire che le immagini al di sotto di una soglia predeterminata (QI < 45) non siano incluse.<ol><li>Per ogni mouse, acquisire quattro volumi vis-OCT dallo stesso occhio. Allineare la testa del nervo ottico (ONH) in ciascuno dei quattro angoli del campo visivo per coprire diverse aree della retina. NOTA: Tale posizionamento riduce al minimo la curvatura retinica, massimizzando la riflettanza RNFL in tutto il FOV. Richiede ~1 minuto per riposizionare l'occhio tra un'acquisizione e l'altra (Figura 1A,B).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Analisi Vis-OCTF NOTA: MATLAB viene utilizzato per eseguire l'analisi delle immagini.<ol><li>Per generare fibrogrammi vis-OCT dal volume vis-OCT, utilizzare un metodo di soglia basato sull'intensità (riga di codice MATLAB 808) per rilevare la superficie della retina. NOTA: Queste linee utilizzano la funzione di regolazione per regolare i valori di intensità del bscan. L'argomento [0.0087 0.08] passato a imadjust specifica l'intervallo di intensità da mappare all'intera gamma dinamica dell'immagine di output.</li>
		<li>Ritaglia l'RNFL selezionando il primo ~16 μm di profondità. Vedere la riga di codice 782 di Matlab. NOTA: Lo spessore tipico di RNFL in vivo in un topo adulto wild-type C57BL/6 è di ~14 μm e può variare tra i diversi metodi di segmentazione13.</li>
		<li>Modificare i percorsi del file RAW (riga 9), File per la ricostruzione (riga 11) e nome del file (riga 15), fare clic su Esegui e attendere che l'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office venga analizzata dal codice MATLAB. Calcola la proiezione dell'intensità media lungo la direzione assiale (z) (linee di codice MATLAB 905-908) per generare l'immagine del fibrogramma composta da fasci di assoni RGC e vascolarizzazione circostante. Montare le quattro immagini dopo l'elaborazione del fibrogramma per ogni FOV allineando i vasi sanguigni con un editor grafico a scelta, coprendo ~1,2 x 1,2 mm in totale. I file RAW vengono solitamente salvati nella cartella: Halo Data, sotto la data dell'imaging OCT (ad esempio, 0606 Opticent). NOTA: I codici MATLAB sono disponibili nel file supplementare 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imaging confocale ex vivo
<ol><li>Eutanasia del topo<ol><li>Dopo aver acquisito i dati vis-OCT, sopprimere i topi con una miscela di pentobarbital sodico (390 mg/mL) e fenitoina sodica (50 mg/mL). La fenitoina sodica agisce amplificando gli effetti del pentobarbital sodico, che è stato ampiamente applicato nell'eutanasia dei roditori14,15. Per ciascun topo, utilizzare 0,2 mL/20 g della miscela diluita (156 mg/mL) e perfuse con 20 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi 20 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS16,17.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione e orientamento dell'occhio<ol><li>Enucleare gli occhi e fare un segno sul lato temporale per indicare l'orientamento.</li>
		<li>Dopo aver rimosso con cura la camera anteriore, il cristallino oculare, il vitreo e fissare le conchiglie oculari in PFA per 30 min.</li>
		<li>Lavare le conchiglie oculari con PBS per 30 minuti e sostituire la soluzione PBS 3 volte durante il lavaggio. Quindi, lavare con Triton X-100 allo 0,5% in PBS (pH 7,5) per 30 minuti.</li>
		<li>Incubare le conchiglie oculari in tampone bloccante (5% siero d'asina con 2,5% albumina sierica bovina e 0,5% Triton X-100 in soluzione salina tamponata Tris [pH 7,5]) per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunocolorazione NOTA: Le conchiglie oculari sono ora pronte per essere colorate con gli anticorpi primari di topo anti-Tuj1 per rilevare i fasci assonali RGC e di ratto anti-ICAM-2 per rilevare i vasi sanguigni.<ol><li>Incubare le conchiglie oculari per una notte con gli anticorpi primari, anti-Tuj1 di topo (1:200 in tampone bloccante) e anti-ICAM-2 di ratto (1:500 in tampone bloccante), a 4 °C.</li>
		<li>Lavare le conchiglie oculari 3-5 volte per 1 ora ogni volta, con una soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,5% di Triton X-100 (PBST) per ridurre al minimo il fondo e rimuovere eventuali anticorpi non legati.</li>
		<li>Dopo il lavaggio, incubare le conchiglie oculari per una notte con gli anticorpi secondari, l'immunoglobulina G anti-topo dell'asino coniugata al colorante Alexa Fluor 488 (fluorescenza verde) e l'IgG anti-ratto dell'asino coniugato al colorante Alexa Fluor 594 (fluorescenza rossa), tutti diluiti 1:1000 in tampone bloccante, a 4 °C.</li>
		<li>Il giorno seguente, lavare le conchiglie oculari 3-5 volte per 1 ora ciascuna con PBST per ridurre al minimo il fondo e rimuovere l'anticorpo non legato.</li>
		<li>Trasferire le conchiglie oculari in una capsula di Petri di PBS prima del montaggio piatto.</li>
	</ol></li>
	<li>Retina piatta<ol><li>Dopo il processo di immunocolorazione, isolare le retine dalle conchiglie oculari al microscopio.</li>
		<li>Tagliare le retine in quattro foglie e montarle in piano con lo strato RGC rivolto verso l'alto. Lasciare il segno sul lato temporale attaccato alla retina per indicare l'orientamento.</li>
		<li>Vetrino coprioggetto delle retine con mezzo di montaggio13,18. Sigillare i vetrini con lo smalto13,18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Imaging confocale NOTA: L'elaborazione delle immagini confocali è stata eseguita utilizzando il software di microscopia ZEN.<ol><li>Accendere il microscopio confocale e, in modalità Localizza, trovare l'area di interesse utilizzando l'oculare del microscopio.</li>
		<li>In modalità di acquisizione, impostare i riquadri in modo da coprire l'intera retina e le sezioni dello z-stack in modo da coprire tutti i livelli di informazioni. Immagine di almeno 25 tessere sull'intera retina per coprire il volume totale di 5,99 mm (x) x 5,88 mm (y) x 30 μm (z) con una dimensione dei pixel di 1,24 μm/pixel.</li>
		<li>Proiettare le fette Z-stack per creare immagini bidimensionali al microscopio confocale en face (Figura 1C,D)11,13,19,20,21.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Allineamento di immagini in vivo ed ex vivo
<ol><li>Dopo aver elaborato il fibrogramma, crea un'immagine composita che includa le quattro immagini acquisite da ciascun mouse allineando tutti i vasi sanguigni con un editor grafico a scelta. NOTA: In media, l'immagine composita finale è di circa 1,2 mm (x) x 1,2 mm (y), come mostrato nella Figura 1B.</li>
	<li>Utilizzare la testa del nervo ottico (ONH) e il modello dei vasi sanguigni come punti di riferimento per allineare il fibrogramma composito. Ottenere l'allineamento in vivo ed ex vivo sovrapponendo il pattern dei vasi sanguigni delle immagini OCT composite con le immagini confocali della stessa retina colorata con ICAM-2.</li>
</ol>

Allineamento del fibrogramma OCT della retina del topo con immagini confocali

<ol>
	<li>Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+retinal+ganglion+cell+structure+and+function.">Development of retinal ganglion cell structure and function.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).</li><li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+types+of+retinal+ganglion+cells:+current+status+and+implications+for+neuronal+classification.">The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification.</a> Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).</li><li>Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture,+function,+and+assembly+of+the+mouse+visual+system.">Architecture, function, and assembly of the mouse visual system.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).</li><li>Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+function,+organization,+and+development+of+the+mouse+superior+colliculus.">Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus.</a> Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).</li><li>Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+glaucomatous+optic+neuropathy:+the+synergy+between+clinical+observation+and+investigation.">Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation.</a> Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).</li><li>Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glaucoma:+thinking+in+new+ways-a+role+for+autonomous+axonal+self-destruction+and+other+compartmentalised+processes.">Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).</li><li>Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+injury+signaling+and+compartmentalized+injury+response+in+glaucoma.">Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).</li><li>Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-dependent+morphological+and+functional+degeneration+of+retinal+ganglion+cells+in+mouse+models+of+experimental+glaucoma.">Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma.</a> Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).</li><li>Tatham, A. J., Medeiros, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+structural+progression+in+glaucoma+with+optical+coherence+tomography.">Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography.</a> Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).</li><li>Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography:+a+review.">Visible-light optical coherence tomography: a review.</a> Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).</li><li>Miller, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy+for+quantitative+imaging+of+retinal+ganglion+cell+axon+bundles.">Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).</li><li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+inner+retinal+layer+structure+in+mice+after+eye-opening+using+visible-light+optical+coherence+tomography.">In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography.</a> Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+regional+damages+in+retinal+ganglion+cell+axon+bundles+monitored+non-invasively+by+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).</li><li>Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+Injection+of+Ethanol+for+the+Euthanasia+of+Laboratory+Mice+(Mus+musculus)+and+Rats+(Rattus+norvegicus).">Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).</li><li>Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiologic,+Behavioral,+and+Histologic+Responses+to+Various+Euthanasia+Methods+in+C57BL/6NTac+Male+Mice.">Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+degeneration+of+retinal+and+superior+collicular+functions+in+mice+with+sustained+ocular+hypertension.">Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).</li><li>Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laser-induced+mouse+model+of+chronic+ocular+hypertension+to+characterize+visual+defects.">A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).</li><li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+experimental+glaucoma+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+in+mice.">Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).</li><li>Thomson, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-1+knockout+mice+as+a+genetic+model+of+open-angle+glaucoma.">Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma.</a> Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+ocular+hypertension+induces+dendritic+degeneration+of+mouse+retinal+ganglion+cells+that+depends+on+cell+type+and+location.">Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).</li><li>Grannonico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+analysis+of+retinal+ganglion+cell+damage+at+individual+axon+bundle+level+in+mice+using+visible-light+optical+coherence+tomography+fibergraphy.">Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy.</a> Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).</li></ol>

Chang, S., Nessuno; Xu, W., Nessuno; Ventilatore, W., Nessuno; McDaniel, J.A., Nessuno; D.A. Mugnaio, Nessuno; M. Grannonico, Nessuno; M. Liu, Nessuno; X. Liu, Nessuno; H.F. Zhang ha interessi finanziari in Opticent Health, che non ha sostenuto questo lavoro.

Ci sono due passaggi in questo protocollo che richiedono attenzione. Innanzitutto, è necessario assicurarsi che l'animale sia in anestesia profonda e che i suoi occhi siano completamente dilatati prima dell'imaging vis-OCT. Se i topi non sono adeguatamente anestetizzati la loro respirazione veloce può portare a movimenti instabili delle immagini en face , che possono influire negativamente sulla qualità del fibrogramma. Inoltre, una dilatazione insufficiente può anche avere un impatto negativo sulla qualità...

Le cellule gangliari retiniche (RGC) svolgono un ruolo fondamentale nell'elaborazione delle informazioni visive, ricevendo input sinaptici attraverso i loro alberi dendritici nello strato plessiforme interno (IPL) e trasmettendo le informazioni tramite i loro assoni nello strato di fibre nervose retiniche (RNFL) al cervello 1,2,3,4. In condizioni patologiche come il glaucoma, la degenerazione precoce di RGC può provocare sottili cambiamenti nell'RNFL, nello strato di cellule gangliari (GCL), nell'IPL e nel nervo ottico sia nei pazienti che nei modellidi roditori 5,6,7,8,9. La diagnosi precoce di questi cambiamenti morfologici nelle RGC è quindi essenziale per un intervento tempestivo per prevenire le RGC e la perdita della vista.
Recentemente abbiamo sviluppato una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCT) per soddisfare la necessità di monitoraggio in vivo del danno RGC. Vis-OCT ha migliorato la risoluzione assiale, raggiungendo 1,3 μm nella retina10,11, consentendo la visualizzazione dei singoli fasci assoniali RGC nell'RNFL. Successivamente, è stata istituita la fibrografia vis-OCT (vis-OCTF) per tracciare e quantificare il danno RGC a livello di singolo fascio assonale nei topi11,12,13. Tuttavia, l'imaging confocale ex vivo della stessa retina del gold standard è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo. Pertanto, questo studio dimostrerà come allineare le immagini in vivo acquisite da vis-OCTF con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina. Il protocollo mira a convalidare i risultati in vivo mediante imaging confocale ex vivo e stabilire una base per esaminare i cambiamenti molecolari e cellulari alla base del danno RGC in condizioni patologiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halo 100</td>
			<td>Opticent Health, Evanston, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM800 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Santz Cruz Biotechnology, SC-281692</td>
			<td></td>
			<td>1-2 drops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin powder</td>
			<td>Fisher Scientific, BP9706-100</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209</td>
			<td></td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL))</td>
			<td>Covetrus, NDC 11695-4860-1</td>
			<td></td>
			<td>15.6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Covetrus, NADA043304</td>
			<td></td>
			<td>114 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Tuj1</td>
			<td>A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia</td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum(NDS)</td>
			<td>Millipore Sigma, S30-100 mL</td>
			<td></td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 
			(Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3</td>
			<td></td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-ICAM-2</td>
			<td>BD Pharmingen, Cat#553325</td>
			<td></td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide drops&#160;</td>
			<td>Covetrus, NDC17478-102-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 
			(Reagent Grade)</td>
			<td>VWR, CAS: 9002-93-1</td>
			<td></td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories Inc. H2000-10</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Covetrus, NDC59399-110-20</td>
			<td></td>
			<td>17 mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

alignment of visible-light optical coherence tomography fibergrams with confocal images of the same mouse retina

Negli ultimi anni, l'imaging retinico in vivo, che fornisce informazioni non invasive, in tempo reale e longitudinali sui sistemi e sui processi biologici, è stato sempre più applicato per ottenere una valutazione obiettiva del danno neurale nelle malattie oculari. L'imaging confocale ex vivo della stessa retina è spesso necessario per convalidare i risultati in vivo , soprattutto nella ricerca sugli animali. In questo studio, abbiamo dimostrato un metodo per allineare un'immagine confocale ex vivo della retina del topo con le sue immagini in vivo . Una nuova tecnologia di imaging clinicamente pronta chiamata fibragrafia per tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) è stata applicata per acquisire immagini in vivo della retina del topo. Abbiamo quindi eseguito l'imaging confocale della stessa retina come "gold standard" per convalidare le immagini in vivo vis-OCTF. Questo studio non solo consente ulteriori indagini sui meccanismi molecolari e cellulari, ma stabilisce anche le basi per una valutazione sensibile e obiettiva del danno neurale in vivo.

Retinal ganglion cells (RGCs) play a critical role in visual information processing, receiving synaptic inputs through their dendritic trees in the inner plexiform layer (IPL) and transmitting the information via their axons in the retinal nerve fiber layer (RNFL) to the brain1,2,3,4. In diseased conditions such as glaucoma, early RGC degeneration may result in subtle changes in the RNFL, the ganglion cell layer (GCL), the IPL, and the optic nerve in both patients and rodent models5,6,7,8,9. Early detection of these morphological changes in RGCs is thus essential for timely intervention to prevent RGC and vision loss.
We have recently developed a new clinical-ready imaging technology called visible-light optical coherence tomography (vis-OCT) to satisfy the need for in vivo monitoring of RGC damage. Vis-OCT improved the axial resolution, reaching 1.3 &#181;m in the retina10, 11, allowing for the visualization of individual RGC axon bundles in the RNFL. Subsequently, vis-OCT fibergraphy (vis-OCTF) was established to track and quantify RGC damage at the single axon bundle level in mice11,12,13. However, ex vivo confocal imaging of the same retina as the gold standard is often necessary to validate the in vivo findings. Therefore, this study will demonstrate how to align in vivo images acquired by vis-OCTF with ex vivo confocal images of the same mouse retina. The protocol aims to validate the in vivo findings by ex vivo confocal imaging and establish a foundation for examining the molecular and cellular changes underlying RGC damage in diseased conditions.

Autore in primo piano: Progressi nell'imaging retinico in vivo ed ex vivo per migliorare la diagnosi e il trattamento del glaucoma 

Allineamento di fibrogrammi per tomografia a coerenza ottica a luce visibile con immagini confocali della stessa retina murina

We present a protocol for aligning in vivo VIS-OCT images with ex vivo immunostained retinal nerve fibers to validate our novel imaging technology. VIS-OCT enables visualization of retinal nerve fibers in vivo, and this process confirms the accuracy of our findings. Our protocol combines in vivo and ex vivo imaging to provide a real time visualization of retina structure and confirm findings.The process is applicable to mouse models of eye diseases, provided the anterior eye portion allows for optical imaging. This includes diabetic retinopathy and retinal ischemia models. These studies lay the foundation for establishing an objective evaluation of neuro damage in humans, which can significantly improve glaucoma diagnosis and treatment in the future.

Il fibrogramma composito vis-OCT viene confrontato con la corrispondente immagine confocale della retina piatta immunocolorata con Tuj-1 per gli assoni RGC (Figura 1D, pannello in alto). I fasci di assoni ripresi da vis-OCTF possono essere abbinati ai fasci di assoni marcati con Tu-j1 sull'immagine confocale. I vasi sanguigni di solito mostrano strutture ramificate distinguibili rispetto ai fasci assoniali circostanti nelle immagini a fibragramma, che possono essere abbinate ai vasi sanguign...

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Il presente protocollo delinea i passaggi per l'allineamento in vivo delle immagini in fibra di tomografia a coerenza ottica a luce visibile (vis-OCTF) con le immagini confocali ex vivo della stessa retina murina allo scopo di verificare la morfologia osservata del fascio assonale delle cellule gangliari retiniche nelle immagini in vivo .

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Presentiamo un protocollo per l'allineamento di immagini VIS-OCT in vivo con fibre nervose retiniche immunocolorate ex vivo per convalidare la nostra nuova tecnologia di imaging. VIS-OCT consente la visualizzazione delle fibre nervose retiniche in vivo e questo processo conferma l'accuratezza dei nostri risultati. Il nostro protocollo combina l'imaging in vivo ed ex vivo per fornire una visualizzazione in tempo reale della struttura della retina e confermare i risultati.Il processo è applicabile a modelli murini di malattie oculari, a condizione che la porzione anteriore dell'occhio consenta l'imaging ottico. Ciò include modelli di retinopatia diabetica e ischemia retinica. Questi studi gettano le basi per stabilire una valutazione obiettiva del danno neurologico nell'uomo, che può migliorare significativamente la diagnosi e il trattamento del glaucoma in futuro.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

883 Views.  University of Virginia. Presentiamo un protocollo per l'allineamento di immagini VIS-OCT in vivo con fibre nervose retiniche immunocolorate ex vivo per convalidare la nostra nuova tecnologia di imaging. VIS-OCT consente la visualizzazione delle fibre nervose retiniche in vivo e questo processo conferma l'accuratezza dei nostri risultati. Il nostro protocollo combina l'imaging in vivo ed ex vivo per fornire una visualizzazione in tempo reale della struttura della retina e confermare i risultati.Il processo è ...

Video: Autore in primo piano: Progressi nell'imaging retinico in vivo ed ex vivo per migliorare la diagnosi e il trattamento del glaucoma 

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

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Neuroscienze

In Vivo Visible Light Optical Coherence Tomography (OCT) Mouse Retinal Imaging

Start by positioning the anesthetized mouse on the animal holder and securing it with two Velcro straps. Turn on the computer and open the software to activate the laser. Adjust the animal holder to center the laser in the mouse's eye.Visualize the posterior part through an on-face preview, the field of view of the superficial vascular plexus, a B scan, and the retina cross-section within the field of view. Acquire a visible light optical coherence tomography, or vis-OCT volume after making minor adjustments to the optical focus. Align the optical nerve head in each of the four corners of the field of view to cover different retinal areas.Use an intensity-based threshold method to detect the retina surface, and generate vis-OCT fiber grams from the volume. Crop the retinal nerve fiber layer, or RNFL, by selecting the first 16 micrometers depth. Next, calculate the mean intensity projection along the axial direction to generate the fiber gram image composed of retinal ganglion cell axon bundles and surrounding vasculature.Align the blood vessels using a graphics editor to montage the four images post-processing. The composite vis-OCT fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat-mounted retina immunostained with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM II labeled blood vessels on the confocal image.Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC exon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Tomografia a coerenza ottica (OCT) a luce visibile in vivo Imaging retinico di topo

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.

Imaging confocale ex vivo della retina del topo

Alignment of In Vivo and Ex Vivo Mouse Retinal Images

Start by creating a composite image using the four obtained images from each mouse. Utilize a graphics editor to align all the blood vessels, employ the optic nerve head and blood vessel patterns as landmarks for aligning the composite fiber gram overlap the composite images and the confocal images of the same retina stained with ICAM2, to achieve in vivo and ex vivo alignment. The composite vis-oct fiber gram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina.Immuno stain with TUJ1 for RGC axons. Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-oct revealed identical RGC Axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.