Name: high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Erika Taylor per l'editing di questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) a R.B., un supplemento di ricerca post-dottorato (R01 HL085481) e comunione (AAUW) a S.B.D. e dall'associazione americana del cuore di S.B.D. e r.t.b.

1. HFD alimentazione protocollo <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> tabella 1. Ricetta di cibo volare. 
La tabella seguente riassume i diversi ingredienti utilizzati per preparare il nostro controllo cibo. Una volta effettuata, 10 mL del cibo è versato in fiale, raffreddato e conservato a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
<ol><li>Preparazione HFD <ol><li>per fare 1 kg di cibo grasso alto, pesare 700 g di alimento normale pre-fatta (cfr. tabella 1) e 300 g di olio di cocco in due contenitori separati usando una bilancia analitica.</li>
		<li>Di calore ogni contenitore individualmente nel microonde, fino a quando il contenuto si fondono completamente. Versare l'olio di cocco nel contenitore per alimenti volare. Mescolare con una frusta fino a quando l'olio è ben amalgamato nel cibo volo. 
		Nota: Nessun pezzi di cibo o di olio devono essere visibile. Quando l'alimento si sta sciogliendo nel microonde, interrompere a intervalli di 1 min a mescolare il cibo ed evitare l'ebollizione.</li>
		<li>Ripesare il cibo grasso alto. Se il peso totale è inferiore a 1 kg (700 g di cibo + 300 g di olio di cocco), aggiungere l'acqua (circa 10 mL) per compensare l'evaporazione durante il riscaldamento e per riportare il peso di 1 kg.</li>
		<li>Versare circa 10 mL di omogeneizzato alto cibo grasso per flaconcino (circa il 25% del volume del flaconcino). Successivamente, coprire con una garza per evitare mosche &#39; contaminazione. Raffreddare per 1 h a temperatura ambiente, poi le fiale a 4 ° C per lo stoccaggio di trasferimento fino a 4 settimane. 
		Nota: Il cibo normale (NF) viene utilizzato come un alimento di controllo. Anche versare 10 mL (circa il 25% del volume di fiala) di NF per flaconcino. Per il cibo HFD, sostituire il 30% del cibo NF con olio di cocco. Per il controllo e condizioni sperimentali, le mosche ci hanno dato la stessa quantità di NF e HFD (10 mL di cibo per flaconcino).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Figura 1 . HFD alimentazione in Drosophila. 
Lo schema mostra le diverse fasi di alimentazione per le mosche su un alimento di controllo (dieta normale senza aggiunta di olio di cocco-NF) o HFD (con l'aggiunta di olio di cocco). L'intero processo richiede 10 giorni dopo la raccolta iniziale di mosche adulte. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"> <li>HFD alimentazione di d. melanogaster Nota: questo protocollo comprende controllo cibo e HFD alimentazione procedure che sono compatibili con qualsiasi linea di volo. Controllo e sperimentali mosche sono messi in flaconcini contenenti lo stesso cibo di quantità (NF o HFD).
	<ol><li>Uso CO 2 ad anestetizzare le mosche. 
		Nota: Per i neofiti, per favore leggi di riferimento 21 per una panoramica sulla generazione e la gestione di d. melanogaster.</li>
		<li>Raccogliere 0-5 mosche di giorno vecchio da fiale e trasferimento (girando) le mosche nei nuovi flaconi contenenti NF (precedentemente riscaldato a temperatura ambiente). Lasciare che l'età di mosche per ulteriori 5 giorni a 21 ° C.</li>
		<li>Alla fine dei 5 giorni, togliere i flaconcini contenenti HFD e NF da 4 ° C. 
		Nota: poiché le temperature fredde possono sollecitare vivente mosche, lasciate le fiale riposare per 30 min a temperatura ambiente per riscaldare prima dell'uso.</li>
		<li>Uso salviettine, pulire e rimuovere il liquido in eccesso dai lati delle fiale.</li>
		<li>Inserire un piccolo pezzo di carta da filtro, circa 1 cm x 3 cm, nell'alto alimento grasso di assorbire qualsiasi liquido in eccesso. 
		Nota: Questo passaggio è fondamentale per prevenire le mosche di attaccarsi al cibo HFD.</li>
		<li>Trasferimento le mosche sul cibo grasso elevato (girando). Posare le fiale orizzontalmente dalla loro parte, (non permanente) 21-22 ° c per 5 giorni. 
		Nota: Evitare temperature superiori come questo può fondere parzialmente il cibo grasso alto, causando le mosche a bastone per il cibo e il die.</li>
		<li>Dopo 5 giorni, trasferimento (girando) le mosche da NF e HFD nei flaconi di nuovi senza cibo per consentire loro coraggio di vuoto per 30 min. Successivamente, procedere alla pesatura le mosche. 
		Nota: Uno dei passaggi critici in questo HFD protocollo di alimentazione è quello di preparare un omogeneizzato HFD, gratuitamente qualsiasi pezzi di cibo volo o olio condensato. Miscelazione omogenea e la HFD a 45-30 ° C di raffreddamento è consigliabile, prima versando in fiale e immagazzinare il cibo all'età corretta di 4 ° C. corrispondenza di controllo e sperimentali mosche è importante così come Priore condizioni nutrizionali e ambientali controllate per l'alimentazione di HFD. Durante la fase di alimentazione, controllo e mosche sperimentale devono essere data la stessa quantità di NF e HFD. Mai raccogliere mosche da sovraffollate fiale o flaconi (per evitare effetti transgenerazionali). Sempre mettere un massimo di 25 mosche per flaconcino durante NF e HFD per evitare la restrizione dietetica o altri effetti di affollamento. La HFD è composto di 30% di olio di cocco, così temperature superiore ai 22 ° C parzialmente potrebbero fondere la HFD, causando le mosche attaccare il cibo oleoso e morire. Prima di indossare le mosche la HFD, pulire le fiale per rimuovere eventuali residui di olio e inserire un filtro di carta per assorbire il liquido in eccesso nel cibo. Durante l'incubazione delle mosche su HFD, le fiale vengono deposte sui loro lati per fornire una superficie orizzontale senza grassi per le mosche.</li>
	</ol></li> <li>Le mosche di pesatura <ol><li>per ciascun genotipo e sesso per essere testato, utilizzare una scala ultra-sensibile per registrare i pesi dei tubi pre-etichettata, vuoto 1,7 mL.</li>
		<li>Utilizzando anestetico Vola o CO 2, anestetizzare e raccogliere 36 mosche dello stesso genotipo, genere, e alimentando uno stato con un pennello pre-pesati 1,7 mL tubo.</li>
		<li>Pesare nella provetta contenente le mosche con la stessa scala ultra-sensibile.</li>
		<li>Determinare il peso medio di volare seguendo questa formula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Nota: il numero di mosche in questo protocollo è 36.</li>
		<li>Flash congelare le provette di 1,7 mL contenenti mosche immergendo nell'azoto liquido per 2 min. raccogliere e mettere i tubi in scatole. Successivamente, trasferire le caselle a-80 ° C (temperatura di preferibile) per deposito fino all'utilizzo con il dosaggio TAG. 
		Attenzione: L'azoto liquido è ad una temperatura estremamente bassa. Si prega di utilizzare l'equipaggiamento protettivo personale appropriato.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG analisi <ol><li>preparazione delle concentrazioni standard TAG <ol><li>preparare 500 mL di PBT (PBS 1X, 0.05% Triton).</li>
		<li>Utilizzando provette da 0,5 mL e la soluzione di TAG (Tabella materiali), preparare 100 µ l di blank (PBT solo) e 100 µ l di sei concentrazioni standard di TAG (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0.125 µ g / µ l; 0,0625 µ g / µ l) con il PBT.</li>
		<li>Mettere i tubi sul ghiaccio e procedere con le mosche di macinazione.</li>
	</ol></li> <li>Rettifica le mosche <ol><li>prendere le mosche congelate da-80 ° C (punto 1.3). Trasferire le provette contenenti le mosche sul ghiaccio</li>
		<li>In primo luogo, disponga 2 mm metallo sfere di macinazione in un dispenser di 96 pozzetti palla, utilizzare un piccolo pennello per rimuovere palle extra.</li>
		<li>Posto la macinazione di 96 pozzetti piastra capovolta in cima al distributore di palla e flip per trasferire le sfere di metallo direttamente nella piastra di macinazione. Ci dovrebbe essere una palla per pozzetto.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 600 µ l di PBT in ogni riga della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Con il forcipe, aggiungere 3 mosche per pozzetto. Indicare la condizione di genotipo, sesso e cibo delle mosche in ogni riga/pozzetto della piastra 96 pozzetti macinazione.</li>
		<li>Posto saldamente i tappi sulla piastra 96 pozzetti rettifica. Nastro può essere posizionato sulla parte superiore per garantire che non vi siano perdite.</li>
		<li>Inserire correttamente le piastre da 96 pozzetti rettifica la rettificatrice. Impostare la macchina per la massima velocità e premere &#34; eseguire &#34; per macinare le mosche per 3 min.</li>
		<li>Dopo 3 min, sospendere la macinazione e procedere con centrifugazione piastra: eleGE per 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Dopo la centrifugazione, gestire la piastra di macinazione con attenzione per evitare di mescolare il surnatante con il pellet.</li>
	</ol></li> <li>Caricamento del campione e determinazione del contenuto di TAG <ol><li>prendere una nuova piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Utilizzando una pipetta multicanale, caricare 200 µ l del reagente TAG in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Di carico 20 µ l di PBT nel pozzo prima della prima riga, per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>carico 20 µ l di ciascuna diluizione standard (dal punto 2.1.2) nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 20 µ l di supernatante da ogni riga del piatto rettifica per la riga corrispondente nella piastra 96 pozzetti spettrofotometro. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Successivamente, inserire un foglio di gas-permeabili sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 10 min. 
		Nota: Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuovere tutte le bolle. La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto della piastra a 550 nm utilizzando un lettore di micropiastre compatibile. Quindi, tracciare la curva standard e determinare la concentrazione [µ g / µ l] dei campioni sconosciuti.</li>
		<li>Per determinare la quantità di contenuto del TAG a medio peso Mosca, utilizzare la seguente formula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Nota: nel presente protocollo, sono stati tritati 3 mosche in 600 µ l di PBT; di conseguenza, il volume medio per volare è 200 µ l.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di Bradford e la normalizzazione del contenuto dei TAG con contenuto proteico <ol><li>preparare sette 100 µ l di albumina di siero bovino (BSA) diluizioni standard (100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 75 µ g/mL; 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) con il PBT.</li>
		<li>Prendere una nuova piastra a 96 pozzetti e caricare 200 µ l di reagente di Bradford X 1 in ogni riga della piastra.</li>
		<li>Nel primo pozzetto della prima riga, aggiungere 10 µ l di PBT per creare uno spazio vuoto. Mescolare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		Pozzi di <li>aggiungere 10 µ l di ciascuna diluizione standard nel restante della prima fila e Miscelare pipettando su e giù. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 10 µ l del surnatante fly da ogni riga del piatto rettifica nella riga corrispondente della piastra a 96 pozzetti. Pipettare su e giù per amalgamare bene. Evitare la formazione di bollicine.</li>
		<li>Posizionare un foglio permeabile al gas sopra la parte superiore della piastra 96 pozzetti.</li>
		<li>Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min. Se ci sono bolle nei pozzetti, centrifugare la piastra per 2 min a 2.000 x g per rimuoverli. 
		Nota: La presenza di bolle interferirà con la lettura dell'assorbanza.</li>
		<li>Uso uno spettrofotometro leggere l'assorbanza dello spazio in bianco, standard e campioni incogniti a 595 nm. Utilizzare la curva standard per determinare le concentrazioni [µ g / µ l] dei campioni in ogni riga.</li>
		<li>Normalizzare il TAG contenuto con livello di proteina utilizzando la seguente formula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+prevalence+of+overweight+and+obesity+in+children+and+adults+during+1980-2013:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2013.">Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013.</a> Lancet. 384, 766-781 (2014).</li><li>Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229 Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm">https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm</a> (2015)</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+development+in+Drosophila+and+its+relationship+to+vertebrates.">Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates.</a> Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).</li><li>Brumby, A. M., Richardson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Drosophila+melanogaster+to+map+human+cancer+pathways.">Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways.</a> Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).</li><li>Chan, H. Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+human+neurodegenerative+disease.">Drosophila models of human neurodegenerative disease.</a> Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).</li><li>Levine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+sequences+homologous+to+a+protein+coding+region+conserved+between+homeotic+genes+of+Drosophila.">Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila.</a> Cell. 38, 667-673 (1984).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Bier, E., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+an+emerging+model+for+cardiac+disease.">Drosophila, an emerging model for cardiac disease.</a> Gene. 342, 1-11 (2004).</li><li>Noyes, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+expression+of+the+Drosophila+adipokinetic+hormone+gene.">Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene.</a> Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).</li><li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+flies+and+men:+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies.">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biol. 11, 38 (2013).</li><li>Rulifson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+insulin-producing+neurons+in+flies:+growth+and+diabetic+phenotypes.">Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes.</a> Science. 296, 1118-1120 (2002).</li><li>Birse, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fat-diet-induced+obesity+and+heart+dysfunction+are+regulated+by+the+TOR+pathway+in+Drosophila.">High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila.</a> Cell Metab. 12, 533-544 (2010).</li><li>Musselman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-sugar+diet+produces+obesity+and+insulin+resistance+in+wild-type+Drosophila.">A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila.</a> Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).</li><li>Diop, S. B., Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gaining+Insights+into+Diabetic+Cardiomyopathy+from+Drosophila.">Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila.</a> Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).</li><li>Williams, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Obesity-Linked+Gene+Nudt3+Drosophila+Homolog+Aps+Is+Associated+With+Insulin+Signaling.">The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling.</a> Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).</li><li>Morris, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster.">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).</li><li>Bodmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gene+tinman+is+required+for+specification+of+the+heart+and+visceral+muscles+in+Drosophila.">The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila.</a> Development. 118, 719-729 (1993).</li><li>Erkkila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fatty+acids+and+cardiovascular+disease:+an+epidemiological+approach.">Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach.</a> Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).</li><li>Ganz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+diet+feeding+results+in+gender+specific+steatohepatitis+and+inflammasome+activation.">High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation.</a> World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).</li><li>Wang, C. Y., Liao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+diet-induced+obesity+and+insulin+resistance.">A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance.</a> Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).</li><li>Stocker, H., Gallant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+started:+an+overview+on+raising+and+handling+Drosophila.">Getting started: an overview on raising and handling Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).</li><li>Mathews, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+Dimorphism+of+Body+Size+Is+Controlled+by+Dosage+of+the+X-Chromosomal+Gene+Myc+and+by+the+Sex-Determining+Gene+tra+in+Drosophila.">Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila.</a> Genetics. 205, 1215-1228 (2017).</li><li>Golay, A., Bobbioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dietary+fat+in+obesity.">The role of dietary fat in obesity.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 21, 2-11 (1997).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Rep. 10, 1-13 (2015).</li><li>Chatterjee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+metabolic+adaptation+to+fasting+by+dILP6-induced+insulin+signaling+in+Drosophila+oenocytes.">Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).</li><li>Palanker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+HNF4+regulates+lipid+mobilization+and+beta-oxidation.">Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation.</a> Cell Metab. 9, 228-239 (2009).</li><li>Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+high-fat+diet+in+stress+response+of+Drosophila.">Role of high-fat diet in stress response of Drosophila.</a> PLoS One. 7, 42587 (2012).</li><li>Kitahara, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+class+III+obesity+(BMI+of+40-59+kg/m2)+and+mortality:+a+pooled+analysis+of+20+prospective+studies.">Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies.</a> PLoS Med. 11, 1001673 (2014).</li><li>Reis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+five+lipid+extraction+solvent+systems+for+lipidomic+studies+of+human+LDL.">A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL.</a> J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).</li><li>Turne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supercritical+fluid+extraction+and+chromatography+for+fat-soluble+vitamin+analysis.">Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis.</a> J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).</li><li>Na, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+model+of+high+sugar+diet-induced+cardiomyopathy.">Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy.</a> PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Induzione di obesità nei topi può richiedere mesi19,20. In mosche, questo HFD alimentazione protocollo consente per l'induzione dell'accumulo di grasso in eccesso in una questione di giorni o meno, causando aumenti in accumulo di grasso solo dopo 18 ore (Vedi Figura 2). HFD alimentando con il protocollo descritto aumenta il glucosio contenuto 12 e diminuisce Bmm lipasi e PGC-1 espressione<sup class=...

Siamo in un tempo dove l'obesità e suoi associati oneri economici, è un problema mondiale1. Due su ogni tre americani sono in sovrappeso o obesi con patologie relative al cuore, la causa primaria di morte entro la popolazione adulta2. Nuovi metodi efficienti sono necessari studiare adeguatamente i componenti genetici e molecolari implicati nella regolazione della sindrome metabolica utilizzando organismi modello. Per questo motivo, abbiamo scelto il moscerino della frutta Drosophila modello perché condivide i più elementari processi biologici con i mammiferi, compreso gli esseri umani e topi3,4,5,6. Genoma di drosophilaè altamente conservato durante l'evoluzione, ma nel complesso molto più piccolo con meno duplicazione genica e di complessità metabolica, che lo rende ideale per la comprensione dei meccanismi fondamentali implicati in molte malattie umane4 , 7 , 8. Inoltre, caratteristici processi effettuati dal tessuto adiposo, intestino e pancreas sono rappresentate in tempo reale e mediare le funzioni di regolamentazione nel metabolismo glucidico e lipidico, ad esempio, che sono simili a esseri umani9, 10,11. Inoltre, la base delle vie molecolari coinvolte nel controllo dell'obesità, insulino-resistenza e diabete negli esseri umani sono funzionalmente conservate in Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. come organismi superiori, Drosophila ha un cuore che batte che si forma durante lo sviluppo di processi simili a quella del cuore di un mammifero3,17. Così, lo sviluppo di un affidabile HFD alimentazione protocollo e throughput elevato TAG dosaggio, adatte a scopi di screening efficiente utilizzando la casella degli strumenti genetici di Drosophila, fornire un importante mezzo per studiare e comprendere le basi genetiche fondamentali malattie metaboliche complesse sottostanti.
Il cibo HFD stesso fatta da un alimento standard del laboratorio integrato con olio di cocco, che è costituita principalmente da acidi grassi saturi, conosciuti per essere associato con la sindrome metabolica18. Mentre che inducono l'obesità nei modelli dei mammiferi, come roditori, può richiedere mesi19,20, nostro HFD ottimizzata protocollo di alimentazione in Drosophila in modo efficace e riproducibile aumenta organismal tenore di materia grassa in una questione di giorni12,14. Questo protocollo, in combinazione con un dosaggio elevato throughput TAG, permette lo screening di massa efficiente per gli effetti di fattori genetici, influenze ambientali e i farmaci candidati per scoprire nuovi modulatori del metabolismo dei grassi. Di conseguenza, questi protocolli sono probabili rilevanti per capire e/o combattere l'obesità e le patologie associate all'obesità.
Il protocollo di alimentazione è versatile e può essere applicato per studiare gli effetti metabolici e funzionali dei singoli acidi grassi saturi o insaturi. L'uso di questo test di velocità effettiva elevata TAG non è limitato a d. melanogaster, ma può essere adattato ad una varietà di organismi modello piccolo con cuticola o dure matrici extracellulari (ad es., altre specie di Drosophila , c. elegans e altri emergenti organismi invertebrati marini modello) per misurare il tenore di materia grassa in differenti condizioni ambientali, genetiche o fisiologiche, in qualsiasi fase di sviluppo, età adulta o fase di malattia metabolica. Il dosaggio di TAG è basato su una misurazione colorimetrica di una serie di reazioni enzimatiche che degradano i tag in acidi grassi, glicerolo, glicerolo 3-fosfato e, infine, H2O2 che reagisce con 4-amminoantipirina (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-idrossibenzene sulfonato (3,5 DHBS) per produrre un prodotto colorato di rosso che viene misurato mediante uno spettrofotometro a 96 pozzetti.

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Grinding Balls, Stainless Steel&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 balls</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case of 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 well microplate flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 plates</td></tr><tr><td>Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 sealing plates</td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>for 10 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>for 200 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>for 100 uL pipette</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super fine forceps</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate Centrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x dye Reagent</td></tr><tr><td>Coconut oil</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gas-permeable Foil</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pieces</td></tr><tr><td>filter Paper</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pack of 100</td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

La malattia di cuore è la causa numero uno di morte umana in tutto il mondo. Numerosi studi hanno dimostrato forti connessioni tra l'obesità e malfunzionamento cardiaco negli esseri umani, ma più strumenti e gli sforzi di ricerca sono necessari delucidare meglio i meccanismi coinvolti. Per oltre un secolo, il modello geneticamente altamente trattabile di Drosophila è stato strumentale nella scoperta di geni chiave e vie molecolari che ha dimostrato di essere altamente conservata tra le specie. Molti processi biologici e meccanismi di malattia sono funzionalmente conservati al volo, come sviluppo (ad es., piano di corpo, cuore), cancro e malattie neurodegenerative. Recentemente, lo studio dell'obesità e patologie secondarie, come le malattie cardiache negli organismi di modello, ha svolto un ruolo molto critico nell'identificazione dei regolatori chiave coinvolti nella sindrome metabolica in esseri umani.
Qui, ci proponiamo di utilizzare questo organismo di modello come strumento efficace per indurre l'obesità, cioè, eccessivo accumulo di grasso e sviluppare un efficiente protocollo per monitorare il contenuto di grassi sotto forma di accumulo di tag. Oltre a altamente conservata, ma meno complesso genoma, al volo ha anche una durata breve per sperimentazione rapida, combinata con rapporto costo-efficacia. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per l'alimentazione di alta dieta di grassi (HFD) in Drosophila per indurre l'obesità e un'analisi di triacylglyceride (TAG) di throughput elevato per la misurazione l'associato aumento nel contenuto di grassi, con l'obiettivo di essere altamente riproducibile e efficiente per lo screening genetico o chimico su larga scala. Questi protocolli offrono nuove opportunità per efficientemente indagare meccanismi regolatori coinvolti nell'obesità, nonché fornire una piattaforma standard per la ricerca di scoperta di farmaci per il test rapido dell'effetto di farmaci candidati sullo sviluppo o prevenzione dell'obesità, diabete e malattie metaboliche correlate.

In d. melanogaster, come è il caso con altre specie, non c'è dimorfismo sessuale tra maschi e femmine22. È noto che le femmine sono più grandi, con più grasso in loro addomi, di maschi22. Per testare l'efficacia del nostro protocollo, abbiamo eseguito saggi di TAG per determinare le differenze di contenuto TAG tra maschi e femmine di laboratorio standard wildtype (w1118) Vola. I dati mostrano che le femmine ...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.2K Views.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Si tratta di una dieta grassa alta alimentazione protocollo per indurre l'obesità in Drosophila, un modello per la comprensione dei meccanismi molecolari fondamentali implicati in lipotoxicity. Fornisce inoltre un'analisi di triacylglyceride throughput elevato per misurare l'accumulo di grasso in Drosophila e potenzialmente altri modelli (insetti) in varie condizioni dietetiche, ambientali, genetiche o fisiologiche.

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The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Ricerca

Genetica

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscienze

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologia

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Dieta grassa alta alimentazione e Throughput elevato dosaggio di Triacylglyceride in Drosophila Melanogaster

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Il TreadWheel: Protocollo di allenamento intervallo per delicatamente indotto da esercizio in Drosophila melanogaster

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Un test di alimentazione a micropiasche ad alta produttività per la quantificazione del consumo in Drosophila

High Throughput test per esaminare Preferenze deposizione delle uova dei singoli

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando

Il capillare alimentatore Assay Misure assunzione di cibo in

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

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