L'obiettivo di questa procedura è fornire indicazioni per la produzione, la cristallizzazione e la determinazione strutturale dell'IKK1-alfa umano al fine di comprendere le basi meccaniche della sua funzione di segnalazione e stabilire piattaforme per la progettazione razionale dei farmaci. Questo metodo dovrebbe aiutare i ricercatori a determinare la struttura di IKK1, che fornirebbe risposte a domande chiave nel campo della segnalazione immunitaria. Questa tecnica descrive un percorso semplificato per ottenere cristalli di proteine IKK, che sono piuttosto refrattarie alla cristallizzazione e per fornire varie informazioni critiche nel superare le strozzature nel determinare le strutture.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché generare quantità di milligrammo di proteine solubili e ben educate, richiede la sua espressione nelle cellule degli insetti e la cristallizzazione può essere eseguita solo in una finestra di condizioni altamente stretta. Anche la procedura di sostituzione molecolare utilizzata per determinare la struttura di IKK1 può essere molto complicata, specialmente a causa della scarsa proprietà di deflessione dei cristalli, non nel sito dell'unità asimmetrica contenente molte molecole di IKK1 in assenza di adeguati modelli di ricerca. A dimostrare le procedure saranno Kyle Shumate e Sonjiala Hotchkiss, studenti del mio laboratorio.
Il primo giorno, placcare le cellule Sf9 in due millilitri di mezzo cellulare per insetti Sf903, in ogni pozzo di un piatto di sei po 'e incubare a 27 gradi Celsius. Passare le cellule quando raggiungono una densità da due a tre volte 10 alle sei cellule per millilitro in sospensione diluerlo a mezzi freschi, ad una densità di circa sei per 10 a cinque. Il secondo giorno, diluire otto microlitri di reagente di trasfezione Sf9 in 100 microlitri di SF-903 o Grace's Insect Medium.
Quindi vortice brevemente la miscela. In un tubo separato, diluire un microgrammo di bacmid ricombinante purificato da kit in 100 microlitri dello stesso mezzo. Unire il DNA diluito e il reagente di trasfezione.
Dopo aver incubato a temperatura ambiente per 15-30 minuti, rimuovere il mezzo dal pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo fresco. Successivamente, aggiungere la miscela di reagente di trasfezione del DNA diluita dropwise sulle cellule, regolando la dimensione della goccia in modo che non spodesta le cellule aderenti.
Dopo sei ore, aggiungere 1,5 millilitri di mezzo fresco sopra le cellule. Incubare le cellule a 27 gradi Celsius, controllando periodicamente i pozzi ogni 12 ore per i segni di infezione virale. Il quinto giorno, rimuovere il mezzo contenente cellule, da 60 a 72 ore dopo l'infezione.
Dopo aver trasferito il mezzo in tubi, centrifugare per cinque minuti a 500 volte g e quattro gradi Celsius. Al termine, salvare il supernatante, che è lo stack di virus P1. Il primo giorno, rimescolare il pellet di cellule His-IKK1 precedentemente preparato in 40 millilitri di tampone di lisi.
Posizionare la sospensione cellulare sul ghiaccio e llyse le cellule per sonicazione a cicli di servizio dal 60% al 70% e da cinque a 10 impulsi di durata di 30 secondi ad un intervallo superiore a un minuto. Chiarire il llysato per centrifugazione a maggiore o uguale a 28.000 g per 45 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver preparato una resina di nichel-NTA agarosio, secondo il protocollo di testo, eludere la proteina alfa IKK1 con etichetta His sotto flusso gravitazionale utilizzando 20 millilitri di tampone di eluizione.
Raccogliere da una a 1,5 frazioni di millilitro. Dopo aver combinato le frazioni contenenti la proteina, digerire il campione con proteasi TEV durante la notte a quattro gradi Celsius. La mattina del secondo giorno, incubare la proteina con un millimolare di ATP, in presenza di cloruro di magnesio, beta-glicerofosfato, fluoruro di sodio e ortovanato di sodio per un'ora a 27 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, filtrare la soluzione proteica attraverso un filtro da 0,45 micron. Quindi caricare circa sei millilitri del campione su una colonna di esclusione delle dimensioni preparativa da 120 millilitri, collegata a un sistema di cromatografia liquida automatizzato. Dopo l'equilibrazione, eseguire la cromatografia ad esclusione di dimensione ad una portata di un millilitro al minuto e raccogliere frazioni di due millilitri.
Durante la corsa, monitorare l'eluizione a 280 e 254 nanometri. Dopo aver tirato le frazioni pure, concentrare in un concentratore centrifugo tagliato a peso molecolare da 30 kilodalton, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi erogare aliquote a 25 microliter della proteina concentrata e congelare flash nell'azoto liquido.
Utilizzando un robot, pipettare da 80 a 100 microlitri di un reagente di cristallizzazione nel serbatoio di una piastra da 96 potte. Utilizzando un robot di cristallizzazione, erogare e mescolare da 0,2 a 0,25 microlitri di IKK1 e il suo complesso inibitore con lo stesso volume di soluzione di serbatoio. Subito dopo aver impostazione le gocce, sigillare ogni piastra con pellicole otticamente chiare per evitare l'evaporazione.
Incubare una piastra a 18 gradi Celsius e l'altra piastra a quattro gradi Celsius in una stanza fredda. Utilizzare un microscopio stereo con un polarizzatore per verificare l'aspetto del cristallo in ogni goccia, ogni giorno, per i primi sette giorni e poi a intervalli più lunghi. Dopo aver preparato IKK1 e il suo complesso inibitore come descritto in precedenza, trasferire le soluzioni di pozzo in ogni pozzo di una piastra da 24 po '.
Posizionare da uno a 1,5 microlitri di soluzione di pozzo su un coperchio di vetro pulito. Aggiungere un volume uguale di IKK1 e il suo complesso inibitore al coverslip di vetro e mescolare delicatamente pipettando su e giù da tre a quattro volte. Dopo aver applicato il grasso sugli anelli di ogni pozzo della piastra, capovolgere il coperchio del vetro e posizionarlo sul rispettivo pozzo con le forcep.
Quindi sigillare il pozzo premendo verso il basso sul coperchio di vetro. Dopo aver sistemato tutte le gocce nella piastra da 24 pozzi, incubare nella stanza fredda, al buio. Occasionalmente controllare le gocce al microscopio per l'aspetto e la crescita dei cristalli.
Una volta completata la crescita del cristallo, rimuovere delicatamente il coverslip di vetro contenente il cristallo e posizionarlo su una superficie solida con la goccia di cristallo rivolta verso l'alto. Aggiungere delicatamente 10 microlitri di crio una soluzione sopra la goccia e mescolare delicatamente con pipettazione in modo che il cristallo non sia toccato. Utilizzando un microscopio, rimuovere lentamente del liquido dal cristallo e mantenere circa cinque-otto microlitri della soluzione.
Aggiungere delicatamente da 2,5 a quattro microlitri di soluzione crio B sulla goccia e mescolare delicatamente con la pipettazione. Coprire il coperchio in vetro con una piccola piastra petrie per evitare il flusso d'aria diretto sul cristallo. Dopo aver atteso cinque minuti, scegliere con cura un singolo cristallo dalla goccia in un crioloop appropriato montato su una base corretta.
Congelare il cristallo in azoto liquido. Quindi conservare il cristallo contenente criopo in un disco immerso nell'azoto liquido in un pallone Dewar fino a quando non è pronto per la diffrazione a raggi X al sincrotrone. Dopo approfonditi studi con diverse varianti di IKK1, i cristalli sono stati ottenuti con un costrutto troncato, che mostrava proprietà a raggi X adatte solo in presenza dell'inibitore IKK XII.
L'effetto combinato dei dati a raggi X a bassa risoluzione con intensità deboli, un gran numero di molecole di IKK1 nell'unità asimmetrica e variazione conformazionale del modello monomerico-dimerico IKK1, rispetto ai modelli IKK2 noti, ha reso difficile ottenere una soluzione di sostituzione molecolare, IKK1, e determinarne la struttura. Diverse strutture IKK2 indicavano diversi orientamenti inter-monomeri all'interno dei suoi dimeri in modo che la distanza tra i carboni alfa di P578 nei due domini della chinasi, in quattro diversi modelli di dimero, variasse tra 39 e 61 angstrom. Ottenere un utile modello di ricerca è stato possibile grazie alla mappa di microscopia crioelettronica a bassa risoluzione e a un modello ad alta precisione di domini IKK1 che potevano essere generati sulla base di una struttura IKK2 ad alta risoluzione.
Il modello iniziale indicava un orientamento del dominio della chinasi ruotato di 24 gradi rispetto a quello di un monomero IKK2 e un'apertura N-terminale di 58 angstrom. Utilizzando uno dei dimeri con l'apertura a 52 angstrom come modello, sono stati localizzati sei dimeri nell'unità asimmetrica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un paio di mesi, se viene eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che l'ottenimento di una proteina solubile, attiva e ben comportata è il primo passo critico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione generale di tutti i passaggi che devono essere seguiti in modo accurato, per avere successo nel cristallizzare e determinare la struttura della proteina IKK1. Imparando questa procedura, ci sono ancora strutture di altre proteine della famiglia IKK che possono anche essere determinate al fine di rispondere a ulteriori domande sulla segnalazione chinasi-mitogeno.
