Il progetto descritto è stato sostenuto da numeri di Grant P01 AI055637 e U54 AI057156 dal NIAID / NIH. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale dei Programmi RCE Office, NIAID, o NIH.

Giorno 1: F. tularensis piastra inoculazione <ol><li> Piastra colture base congelate di F. tularensis su Mueller-Hinton agar integrato con il 2,5% (vol / vol) donatore nel siero di vitello, 2% (vol / vol) IsoVitaleX, 0,1% (peso / volume) di glucosio, e 0,025% (peso / volume) pirofosfato di ferro. Crescere F. tularensis a 37 ° C con 5% di CO 2 per circa 24 h. </li></ol> Giorno 2: F. tularensis inoculazione liquido dei media <ol><li> Preparare e autoclave 1 litro di cationi regolato Mueller-Hinton medio (1,23 contenente cloruro di calcio diidrato mM e 1,03 mM cloruro di magnesio esaidrato). Quando sono raffreddati a 37 ° C, media ulteriore supplemento con 0,1% (peso / volume) di glucosio, pirofosfato di ferro 0,025% (peso / volume), e il 2% (vol / vol) IsoVitaleX. Filtro sterilizzare (0,22 μ) di media in due aliquote da 500 ml. </li><li> 12 ml di rimuovere integrato Mueller-Hinton media e il trasferimento in una sterile da 50 ml tubo Falcon. </li><li> Usando una sterile 10 microlitri ansa da inoculo, raschiare un&#39;ansata grande di F. crescita tularensis da piastre di agar (dal giorno 1) e batteri trasferimento in 12 ml di Mueller-Hinton medio (vedi punto 2). Volte la soluzione più pipetta di break-up grumi e preparare omogenea sospensione batterica. Non vortice. </li><li> Utilizzando una pipetta sterile, inoculare ciascuna da 500 ml vaso con 5 ml di sospensione batterica dal punto 3. Grow culture brodo a 37 ° C per 14 a 18 h agitando delicatamente (190-200 giri al minuto su un Brunswick New Innova serie 2300 shaker). </li></ol> 3 ° giorno: Spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità centrifugazione gradiente di saccarosio <ol><li> Ottenere F. culture tularensis dal agitazione incubatore e rimuovere una da 1 ml aliquota da ogni 500 ml di cultura per verificare la densità rispettive ottiche. Abbiamo trovato l&#39;estrazione ottimale della membrana e dei risultati quando si usa l&#39;isolamento F. cellule tularensis all&#39;inizio fase logaritmica di crescita, che si correla con un diametro esterno 600 tra 0,2 e 0,4 (~ 10 LUGLIO - 10 AGOSTO UFC / ml). Culture, con un diametro esterno 600 inferiore a 0,2 non produrrà quantità sufficiente di materiali membrana totale per le sfumature saccarosio successive. Al contrario, le culture con un diametro esterno 600 superiore a 0,4 (in via di fase stazionaria) sono stati trovati per produrre misto membrana fusioni. </li><li> Centrifugare culture a 7.500 x g per 30 minuti a 15 ° C per raccogliere le cellule. Si consiglia di centrifugazione di culture in quattro bottiglie da 250 ml centrifuga, perché facilita successiva sospensione a pellet. </li><li> Rimuovere con attenzione il sopranatante media da ogni bottiglia centrifuga e picchiettare le bottiglie in materiale assorbente per eliminare l&#39;eccesso di crescita medio. </li><li> Entro 10 minuti dopo il completamento della centrifugazione, ogni sospensione batterica pellet in 8,75 ml di saccarosio 0,75 M (in 5 mM Tris, pH 7,5). Tutti e quattro i pellet batterico deve essere sospeso e trasferito (35 totale ml di sospensione batterica) ad una sterile pallone da 250 ml (con un piccolo stirbar) entro 10 minuti. </li><li> Mentre dolcemente mescolando la sospensione cellulare su un stirplate, aggiungere lentamente 70 ml (2 volumi) di 10 mm disodico EDTA (in 5 mM Tris, pH 7.8) nel corso di 10 min. Aggiungere la soluzione di EDTA con la punta della pipetta di sotto del livello di sospensione cellulare al fine di evitare elevate concentrazioni locali di EDTA. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente per mescolare completamente la sospensione cellulare, ma non abbastanza veloce da provocare la formazione di schiuma o bolle. Dopo la soluzione di EDTA è stato aggiunto, incubare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 30 minuti, aggiungere lentamente 11 ml (° 1 / 10 del volume) di un mg / ml 2 soluzione di lisozima alla concentrazione finale di 200 mg / ml. Continuare a mescolare la sospensione cellulare durante l&#39;aggiunta soluzione di lisozima. Come notato sopra, aggiungere la soluzione di lisozima con la punta della pipetta di sotto del livello del liquido cellulare sospensione per evitare elevate concentrazioni locali di lisozima. Soluzioni madre lisozima (2 mg / ml) possono essere preparati in monouso aliquote e conservati a -20 ° C per 3-4 mesi. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante l&#39;incubazione 30 minuti, preparare un pallone sterile 1L con un piccolo stirbar e 530 ml di temperatura ambiente Cellgro Molecolare Grado dH 2 O (4,5 volumi). </li><li> Osmoticamente lisare la sospensione cellulare (a partire dal punto 6) per diluizione lenta (velocità di flusso di circa 11 ml / min) in 530 ml di dH Molecolare Grado 2 O (dal punto 7) nel corso di 10 a 15 minuti con miscelazione delicata. A causa del volume della soluzione più grandi in questa fase, aumentare la velocità stirbar per garantire la corretta miscelazione. Il stirbar dovrebbe essere a rotazione ad una velocità sufficiente a disperdere completamente la sospensione cellulare, una volta aggiunti ai 2 dH O, ma non abbastanza veloce per portare alla formazione di schiuma o bolle. Aggiungere la sospensione cellulare con la punta della pipetta appoggiato sul fondo del pallone, adiacente al stirbar, per facilitare la diluizione uniforme del cell sospensione. Abbiamo scoperto che da 25 ml pipette funzionano meglio durante questa fase. Monitorare attentamente il processo di diluizione e interrompere il flusso, se necessario, per disperdere gli accumuli locali di cellule, ammassi di cellule, e ciuffi cellulare. Incubare la soluzione così ottenuta per 30 minuti a temperatura ambiente. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 30 minuti, trasferire 40 ml di soluzione di lisi osmotica in tubi conici da 50 ml e centrifugare a 7500 xg per 30 minuti a 10 ° C per rimuovere le cellule intatte e detriti. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela 27-30 ml di surnatante da ogni tubo conico e surnatanti piscina in un recipiente sterile 1L </li><li> Trasferire 25 ml di surnatante in pool, ciascuna, in 16 tubi ultracentrifuga e centrifugare a 200.000 g (44.400 rpm in F50L-8x39 rotore Fiberlite ultracentrifuga) per 2 ore a 4 ° C. Si noti che ogni rotore contiene 8 tubi, così questo passo richiede due rotori e due ultracentrifughe. In alternativa, la seconda serie di 8 tubi dovrebbero essere tenute a 4 ° C fino centrifugato. </li><li> Entro 10 minuti della fine del percorso ultracentrifuga, preparare modificato risospensione del buffer membrana. Trasferimento 8 ml di tampone membrana sospensione (25% [wt / wt] saccarosio, 5 mM Tris, 30 mM MgCl 2) in una provetta sterile e aggiungere 1 compressa di EDTA-free cocktail inibitori della proteasi e 375 U di benzonasi. Mescolare delicatamente la soluzione per sciogliere inibitore della proteasi compressa. </li><li> A seguito di ultracentrifugazione, accuratamente versare off surnatanti, invertire i tubi ultracentrifuga su materiale assorbente e picchiettare tubi per rimuovere il surnatante in eccesso. Segnare la posizione di ciascun pellet membrana con un pennarello per aiutare nella visualizzazione. Risospendere delicatamente otto pellet membrana con 600 microlitri di tampone ogni membrana modificata risospensione. Trasferimento di ogni risospensione membrana per la prossima serie di otto tubi, risospendere delicatamente questi otto pellet, e la piscina resuspensions membrana risultante in un tubo sterile. Le membrane di pellet sono difficili da riportare in sospensione, in modo da continuare a passare la modifica tampone risospensione membrana sopra il pellet fino a quando non si stacca dalla parete del tubo. Spesso è necessario utilizzare la punta micropipetta per raschiare il pellet membrana al largo della parete del tubo e gli aiuti nel processo di risospensione. Quando pipettaggio, evitare la formazione di schiuma o formazione di bolle. Si noti che questo passo sembra essere una delle più difficili e critici per il successo globale di questo esperimento. </li><li> Quando la membrana pellet sono stati risospesi e rimosso da tutti i 16 tubi, lavare ogni quattro tubi con 600 ml di buffer di membrana modificata risospensione. Il lavaggio dovrebbe essere focalizzata intorno alla zona segnata (membrana pellet) di ciascun tubo. Trasferire il lavaggio nel tubo risospensione membrana. Ripetere la fase di lavaggio per i restanti tre serie di quattro tubi. </li><li> Incubare la risospensione membrana con dondolo dolce per 30 minuti a temperatura ambiente per degradare il DNA e l&#39;aiuto nella riduzione del materiale flocculante. </li><li> Rimuovere una piccola aliquota della sospensione membrana ed eseguire la quantificazione di proteine ​​per determinare la resa totale della membrana. Noi di solito preparare non diluito, diluito 1:1 (nel 2,5% SDS), e 1:3 diluito (nel 2,5% SDS) i campioni di membrana, i campioni di calore a 90 ° C per 10 minuti, e utilizzare il BioRad DC Protein Assay per quantificare la membrana risospensione concentrazione proteica. Resa di proteine ​​totali è generalmente compreso tra 1,0 mg / ml e 1,6 mg / ml. L&#39;utilizzo di calore e di SDS sono tenuti a rilasciare OMP dalle membrane estratte in modo che una più accurata quantificazione del valore proteico può essere ottenuto. </li><li> Preparare gradienti di saccarosio lineare stratificazione 1,8 ml ognuna delle soluzioni di saccarosio (peso / peso, preparata in 5 mM EDTA, pH 7,5) in 14 x 95 mm Ultra-Clear tubi ultracentrifuga nel seguente ordine: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Stratificazione di gradienti di saccarosio è più facile da eseguire quando si utilizza una pipetta a bulbo, non un pipettatore automatico. </li><li> Basato sulla quantificazione delle proteine ​​di membrana risospensione (Step 16), strato di 1,5 mg di risospensione membrana in cima ad ogni pendenza. Ogni x 14 95 tubo ultracentrifuga mm ha una capacità massima di 12,5 ml e, visto che 10,8 ml è rappresentata dalle soluzioni di saccarosio a partire dal punto 17, non si deve caricare più di 1,7 ml di risospensione membrana per gradiente. Peso individuale e regolare con cura il peso finale di ogni tubo gradiente di saccarosio (aggiungendo o rimuovendo risospensione membrana) in modo che tutti i tubi pesano uguali (± 0,01 g). </li><li> Trasferimento gradienti di saccarosio in una SW-40Ti rotore oscillante e centrifugare a 256.000 x g (38.000 rpm) per un minimo di 17 ore a 4 ° C. </li></ol> Giorno 4: Raccolta delle frazioni gradiente di saccarosio <ol><li> Dopo 17 h di centrifugazione, fermare la corsa centrifuga, e rimuovere attentamente gradienti di saccarosio dalla SW-40Ti rotore. </li><li> Pulire accuratamente la parte inferiore del tubo gradiente di saccarosio con il 70% di etanolo, la punturafondo della provetta con un ago 21G, e raccogliere frazioni sequenziale 500 microlitri dal gradiente in provette sterili microcentrifuga. Ripetere l&#39;operazione per gradienti successive. Il gradiente dovrebbe essere consentito a gocciolare dal flusso di gravità, in modo da non disturbare il gradiente di saccarosio. Tuttavia, se il gocciolamento cessa dalla parte inferiore del tubo di pendenza, una piccola quantità di pressione può essere applicato alla parte superiore del tubo usando un dito. </li><li> Determinare l&#39;indice di rifrazione di ogni frazione gradiente di saccarosio utilizzando un rifrattometro e correlare l&#39;indice di rifrazione con una densità specifica in g / ml 1. Valutare la localizzazione delle proteine ​​con la preparazione rappresentante frazioni gradiente di saccarosio (incrementi di densità di 0,01, da 1,11 g / ml a 1,26 g / ml) per SDS-PAGE la separazione, il trasferimento di nitrocellulosa, e immunoblotting. </li></ol> Rappresentante Risultati Quando eseguito correttamente, questa procedura comporta la completa separazione di IM e vescicole OM sia da Tipo A (ad esempio SchuS4) e di tipo B (per esempio LVS) ceppi di F. tularensis. Come mostrato in immunoblot rappresentante nella Figura 1, F. OMP tularensis localizzare tra densità di 1,17 e 1,20 g / ml. In confronto, PIM localizzare tra densità di 1,13 e 1,14 g / ml. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Immunoblotting di F. tularensis gradienti di densità di saccarosio. Frazioni sequenziali sono stati raccolti da sfumature e densità (g / ml) sono stati calcolati sulla base degli indici di rifrazione. Le proteine ​​sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferite su nitrocellulosa, e immunoblotted per rilevare OMP e frazionamento IMP. mw, prestained standard di peso molecolare con dimensioni (in kDa) ha notato sul lato sinistro di ogni macchia. LVS, lisati di cellule intera F. tularensis LVS. La densità di saccarosio corrispondente frazione del gradiente sono notati sopra le loro rispettive corsie. OMP e PIM, come indicato sul margine sinistro, sono stati rilevati con policlonali, antisieri monospecifici. Risultati simili sono stati ottenuti per F. tularensis SchuS4.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo descrive una variazione del spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità del gradiente di saccarosio &quot;gold standard&quot; centrifuga per la separazione fisica e l&#39;arricchimento di batteri Gram-negativi OM da altri componenti cellulari 2, 3, 4. Mentre noi precedentemente descritto l&#39;applicazione di questo metodo per isolare OM da entrambi i ceppi di tipo A e tipo B di F. tularensis 5, questa presentazione offre una procedura più dettagliata e ottimizzata per l&#39;isolamento OM. In effetti, questo è un importante passo avanti per identificare potenzialmente superficie esposta e fattori di virulenza presuntiva da questo patogeno mortale. Il significato di questa procedura è stata dimostrata in studi dal nostro laboratorio mostrano che l&#39;immunizzazione di topi con OMP purificata garantita una sostanziale protezione contro la virulenta Tipo A F. tularensis sfida polmonare 6. Come notato sopra, fase di crescita delle cellule batteriche, un attento monitoraggio durante la lisi osmotica e risospensione del pellet delicata membrana sono passaggi critici che sembrano correlare con successo / insuccesso di questa procedura di separazione a membrana. Mentre questo metodo ottimizzato è rigorosa e soggetta a variabilità sperimentale, il conseguente OM sembrano essere di purezza molto maggiore rispetto a quelli ottenuto dall&#39;uso di detergenti, cloruro di litio, sodio o carbonato di 7, 8, 9, 10, 11, 12.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Donor calf serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>35-022-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IsoVitaleX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>211876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cellgro molecular grade dH2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech</td>
<td>46-000-CM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>38.5 ml polycarbonate bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>010-0514</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F50L-8x39 ultracentrifuge rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FiberLite</td>
<td>096-087051</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>04693132001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzonase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Novagen</td>
<td>70664-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DC protein assay</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>500-0116</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-Clear 14x95mm centrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>344060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SW-40Ti swinging bucket rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>331301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Abbe benchtop refractometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-964-10 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

method for the isolation of francisella tularensis outer membranes

Francisella tularensis è un batterio Gram-negativo coccobacillus intracellulare e l&#39;agente eziologico della tularemia zoonosi. Rispetto ad altri batteri patogeni, la dose infettiva estremamente basso (&lt;10 CFU), malattia a progressione rapida e alta morbilità e mortalità indicano che i ceppi virulenti di Francisella codificano per fattori di virulenza romanzo. Superficie esposta molecole, proteine ​​di membrana e cioè esterna (OMP), hanno dimostrato di promuovere la cellula batterica ospite vincolante, entrata, sopravvivenza intracellulare, la virulenza e l&#39;evasione del sistema immunitario. La rilevanza per lo studio OMP è ulteriormente sottolineata dal fatto che essi possono servire come vaccini protettivi contro una serie di malattie batteriche. Mentre OMP può essere estratto da batteri gram-negativi attraverso le tecniche di estrazione di massa della membrana, tra cui sonicazione di cellule seguita da centrifugazione e / o estrazione detergente, questi preparati sono spesso contaminati da periplasmatico e / o citoplasmatica (interno) della membrana (IM) i contaminanti. Per anni, il &quot;gold standard&quot; metodo per la separazione biochimica e biofisica della gram-negativi IM e membrane esterne (OM) è stato quello di batteri sottoposti a lisi spheroplasting e osmotica, seguita da centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio. Una volta stratificato su un gradiente di saccarosio, OM può essere separata da IMS sulla base delle differenze nella densità di galleggiamento, crede di essere in gran parte basata sulla presenza di lipopolisaccaride (LPS) in OM. Qui, descriviamo un metodo rigoroso e ottimizzato per estrarre, arricchire, e isolare F. tularensis membrane esterne e le loro OMP associati.

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Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Un protocollo per la separazione di membrane interna ed esterna da<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; Da spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

Metodo per l&#39;isolamento di Francisella tularensis Membrane esterne

Francisella tularensis is a Gram-negative intracellular coccobacillus and the causative agent of the zoonotic disease tularemia. When compared with other ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

16.9K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. Un protocollo per la separazione di membrane interna ed esterna da Francisella tularensis Da spheroplasting, la lisi osmotica, e la densità ultracentrifugazione gradiente di saccarosio.

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A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

A Rapid, metodo scalabile per l&#39;isolamento, studio funzionale, e analisi di Cell-derivati ​​matrice extracellulare

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Metodo standardizzato per la sterilizzazione di High-throughput di semi di Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Membrane lipidiche a doppio strato tethered per monitorare il trasferimento di calore tra nanoparticelle d'oro e membrane lipidiche

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.