Questo protocollo consente la caratterizzazione del traffico intracellulare e della secrezione di proteine di membrana basale utilizzando l'array Drosophila come sistema modello. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che consente l'imaging ad alta risoluzione del traffico intracellulare di proteine della membrana basale utilizzando proteine marcate endogenamente e microscopia a super-risoluzione Airyscan. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per visualizzare il traffico intracellulare delle proteine della membrana basale, può essere esteso per studiare il traffico di altre proteine di interesse e altri sistemi biologici, tra cui colture cellulari e organoidi.
Per iniziare, dopo aver sezionato le ovaie di Drosophila in PBS sotto un ambito di dissezione, aggiungere un millilitro di soluzione di fissazione e fissare le ovaie su una piattaforma di nutating per 15 minuti. Rimuovere la soluzione di fissaggio ed eseguire due lavaggi rapidi, ciascuno con un millilitro di PBST. Invertendo delicatamente i tubi della microcentrifuga da cinque a sei volte, quindi eseguire quattro lunghi lavaggi di 10 minuti ciascuno con un millilitro di PBST su un bilanciere a piattaforma nutating.
Dopo aver eseguito la fissazione e il lavaggio, rimuovere PBST, quindi aggiungere un millilitro di soluzione bloccante e bloccare le ovaie su un bilanciere a piattaforma nutating per un minimo di un'ora. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale primaria, contenenti anticorpi primari diluiti alle loro concentrazioni appropriate in soluzione bloccante. Incubare durante la notte su un bilanciere a piattaforma nutating a 4 gradi Celsius.
Dopo aver rimosso la soluzione anticorpale primaria, eseguire due lavaggi rapidi e quattro lavaggi lunghi, come dimostrato in precedenza, quindi rimuovere PBST e aggiungere 500 microlitri di soluzione anticorpale secondaria contenente anticorpi secondari fluorescenti che rileveranno gli anticorpi primari utilizzati. Incubare le ovaie nella soluzione anticorpale secondaria su un bilanciere a piattaforma nutating per due ore a temperatura ambiente, quindi eseguire due lavaggi rapidi e quattro lunghi lavaggi in PBST come dimostrato in precedenza su un bilanciere a piattaforma nutating. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una pipetta P-1000 per pipettare delicatamente le ovaie su e giù nel tubo per separare le camere delle uova.
Lasciare che le camere delle uova affondino sul fondo mantenendo il tubo in posizione verticale per cinque o 10 minuti. Quindi, rimuovere PBST utilizzando una pipetta Pasteur, lasciando circa 50 microlitri. Successivamente, rimuovere il più possibile il PBST rimanente utilizzando una pipetta P-200 e aggiungere due gocce di mezzo di montaggio, sufficienti per distribuire uniformemente su uno slittamento di copertura.
Per consentire un facile trasferimento del mezzo di montaggio viscoso alla slitta dal tubo microcentrifuga, tagliare l'estremità di una punta della pipetta P-200. Quindi, trasferire lentamente tutte le camere delle uova nel mezzo di montaggio sul vetrino, assicurandosi di non creare bolle. Sotto un microscopio di dissezione, stendere delicatamente il supporto di montaggio e separare le camere delle uova utilizzando una nuova punta o pinza per pipetta P-200 per coprire un'area delle dimensioni di una slitta di copertura.
Usando la pinza, posizionare con attenzione il coperchio scivolare sulle camere delle uova ad angolo per evitare bolle e conservare il vetrino a temperatura ambiente su una superficie piana al buio per due giorni per polimerizzare. Una volta che il supporto di montaggio è indurito, il vetrino può essere conservato a 4 gradi Celsius al buio per alcune settimane per l'imaging. Per visualizzare la localizzazione intracellulare delle proteine della membrana basale, impostare l'obiettivo su 63x e posizionare delicatamente una goccia di olio per immersione sulla lente, quindi posizionare la diapositiva sull'obiettivo con lo slittamento di copertura rivolto verso l'obiettivo per localizzare il campione.
Individuare la regione di interesse utilizzando l'oculare del microscopio epifluorescente, quindi selezionare una configurazione con impostazioni appropriate per l'immagine dei fluorofori come descritto nel manoscritto. Una volta impostata la configurazione, visualizzare l'immagine del campione selezionando Live in modalità di acquisizione e regolare lo zoom tra 2 e 4x per ottimizzare l'area di scansione del campione. Per ogni singolo canale, seleziona una traccia sotto Canale e fai clic su Live.
Regola il guadagno principale e la potenza del laser mentre usi lo strumento indicatore di gamma e segui tutte le linee guida per evitare pixel saturi come descritto nel manoscritto, ripetendo lo stesso per ogni canale. Nella finestra di commutazione modalità di acquisizione, in Dimensioni immagine, fare clic su SR per massimizzare le capacità del rilevatore e regolare automaticamente le dimensioni del fotogramma. Mantenere la media su Nessuno in modalità Airyscan in quanto di solito non è necessaria e ridurrà il tempo di scansione.
Tuttavia, in alcuni casi, una media di 2x può migliorare il rapporto segnale-rumore, quindi fare clic su Snap per acquisire un'immagine. Per acquisire uno Z-stack, fare clic sulla casella di controllo Z-Stack nella scheda Acquisizione. Quindi, selezionare il canale desiderato per osservare il campione.
Ad esempio, il canale DAPI e fare clic su Live per avviare una scansione dal vivo, quindi impostare un intervallo per lo Z-stack utilizzando la manopola di regolazione fine sul microscopio. Successivamente, impostare i punti finali dello stack Z facendo clic su Imposta prima e Imposta ultimo. Per una ricostruzione 3D ottimale, impostare l'intervallo per lo Z-stack inferiore a 0,5 micrometri per assegnare la dimensione del passo e fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'acquisizione dello stack Z.
Una volta ottenute le immagini o Z-stack, fare clic sull'opzione Elaborazione, quindi metodo e selezionare Elaborazione Airyscan. Eseguire il filtro automatico per avviare e, se necessario, eseguire un'ulteriore elaborazione manuale modificando il valore di super risoluzione per ottenere i migliori risultati per il campione. Dopo aver determinato il valore SR ottimale, fare clic su Applica per generare un'immagine elaborata.
Nel caso di immagini Z-stack, elaborare come una Z-slice o come l'intero Z-stack facendo clic sulla casella Elaborazione 3D. Per visualizzare il traffico proteico in 3D dopo l'acquisizione di uno Z-stack, generare un'immagine 3D facendo clic sull'icona 3D nella finestra di anteprima, che apparirà nella sezione di controllo del display dell'immagine elaborata airyscan. Dalle diverse opzioni di visualizzazione 3D, utilizzate viste superficie o viste miste quando visualizzate la struttura delle vescicole.
Per un'immagine di qualità superiore, selezionare l'impostazione Precisa poiché l'impostazione Più veloce sarà meno accurata e porterà a un rendering 3D scadente. Una volta generata l'immagine, manipola l'immagine 3D ingrandendola e ruotandola per mettere a fuoco una posizione preferita. Dopo aver ottenuto la vista, nella scheda 3D selezionare Risoluzione visualizzata, quindi fare clic su Crea immagine, che creerà un'istantanea dell'immagine nello stesso orientamento in cui è stata visualizzata e può essere salvata ed esportata in vari formati di file.
La microscopia confocale può essere utilizzata per visualizzare la localizzazione intracellulare e la deposizione di proteine di membrana basale come Viking-GFP quando i parametri di acquisizione sono ottimizzati. Quando l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini vengono eseguite correttamente, la microscopia a super-risoluzione aumenta la risoluzione dell'immagine rispetto alla microscopia confocale. Come illustrato dalle immagini meglio definite nel traffico intracellulare di proteine della membrana basale, come Viking.
La proiezione ortogonale consente la visualizzazione della distribuzione complessiva di vescicole e compartimenti contenenti proteine della membrana basale in un'unica immagine utilizzando immagini confocali o a super-risoluzione. Una ricostruzione 3D assemblando una pila di sezioni Z ottiche prelevate mediante imaging confocale o super-risoluzione è stata impiegata per valutare la localizzazione e la distribuzione delle proteine della membrana basale intracellulare. L'imaging a super-risoluzione può essere utilizzato per determinare la localizzazione precisa delle proteine della membrana basale in condizioni mutanti.
Ad esempio, nelle cellule epiteliali di Crag knockdown, le proteine della membrana basale si accumulano sia apicalmente che basalmente, indicando che controlla la secrezione polarizzata delle proteine della membrana basale. La microscopia confocale e a super-risoluzione può anche essere impiegata in esperimenti di co-localizzazione. Ad esempio, questa figura mostra la co-localizzazione parziale di Viking-GFP e un marcatore Di Golgi, GM-130, confermando che Viking è ordinato al Golgi prima della secrezione.
Per visualizzare in modo efficiente il traffico di proteine di membrana basale utilizzando la microscopia a super-risoluzione, si consiglia di montare con attenzione le ovaie e prestare particolare attenzione quando si impostano i parametri di acquisizione e convoluzione. Questo protocollo è ottimizzato per visualizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale. Tuttavia, può essere facilmente modificato per visualizzare in modo efficiente il traffico di altre proteine di interesse.
