Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle proteine fluorescenti come come le proteine fluorescenti possono influenzare i loro partner di fusione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una valutazione rapida e facilmente scalabile degli effetti delle proteine fluorescenti e dei loro partner di fusione. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul comportamento delle proteine fluorescenti, può anche essere applicato ad altri tag geneticamente codificati.
A dimostrare questa procedura sarà anche Sonja Di Gregorio, laureata alla Western University. Ogni proteina fluorescente testata con questo metodo viene prima clonata in un vettore di espressione del lievito che codifica una versione induttabile di galattosio dell'esone HTT contrassegnato da FLAG che ospita la ripetizione 25Q non tossica o la ripetizione toxic 72Q della malattia di Huntington associata. I cloni vengono selezionati e verificati sequenziando e successivamente trasformati in lievito.
Per preparare colture cellulari per i vari saggi, striare i cloni di lievito che trasportano tag 25Q o 72Q con una proteina di fluorescenza di interesse su una piastra di agar contenente mezzo di selezione del lievito con glucosio come fonte di carbonio. Allo stesso tempo, il lievito striato che trasporta 25Q o 72Q lievito ha ottimizzato la supercartella monomerica GFP per fungere da controllo positivo. Incubare le piastre a 30 gradi Celsius per due o tre giorni.
Selezionare fino alle tre singole colonie da ogni piastra e inoculare cinque millilitri di mezzo sintetico completo integrato con il 2% di glucosio come fonte di carbonio. Incubare le colture a 30 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, trasferire 200 microlitri di ogni coltura notturna su un tubo di microcentrifugo e centrifuga per pellettizzare le cellule.
Lavare almeno tre volte con acqua distillata sterile. È importante lavare bene le cellule per eliminare tutte le tracce di glucosio che potrebbero contribuire a reprimere l'induzione del promotore GAL1. Preparare le cellule come dimostrato in precedenza e sospenderle di nuovo in un supporto completo sintetico contenente il 2% di galattosio come fonte di carbonio per indurre l'espressione di fusioni poliQ.
Come controllo, sospendere di nuovo le cellule nei mezzi contenenti glucosio. Incubare le cellule a 30 gradi Celsius in un rotatore di tubi durante la notte. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 600 nanometri di ogni coltura usando uno spettrofotometro.
Equalizzare le densità cellulari ad una densità ottica 600 di 2 microlitri su 100 di mezzo sintetico completo in una piastra sterile da 96 pozzetti. Preparare quattro diluizioni di cinque volte di ciascun campione pipettando 20 microlitri del campione dal pozzo precedente in 80 microlitri di supporti nel pozzo successivo. Utilizzare uno strumento di inchiodamento del lievito per individuare le cellule su piastre selettive e incubare a 30 gradi Celsius per due giorni.
Immagini le lastre con un dispositivo di documentazione dell'immagine. Preparare le colture cellulari per questo saggio e quindi misurare l'OD600 di ogni coltura utilizzando uno spettrofotometro. Diluire le cellule in un OD600 di 1 microlitri su 300 di supporti nella piastra da 96 pozzi.
Preparare ogni campione in triplice copia. Incubare la piastra in un incubatore di lettore di lastre con capacità di scuotimento. Impostare il numero di campioni, la temperatura a 30 gradi Celsius, l'assorbanza a 600 nanometri, la lunghezza degli esperimenti a 24 ore e gli intervalli di misurazione a 15 minuti.
Selezionare la modalità di agitazione continua. Al termine dell'esperimento, creare la curva di crescita e quantificare l'area sotto la curva utilizzando un software di grafica scientifica. Incollare i dati in una tabella XY con tre valori di replica.
La curva di crescita verrà visualizzata sotto la cartella grafici sul lato sinistro. Per quantificare l'area sotto la curva, selezionate analizza in alto a sinistra e fate clic sull'area sotto curva nelle analisi XY. Iniziare questa procedura diluire le cellule preparate 10 volte nel mezzo di crescita.
Trasferire 200 microlitri di ciascun campione in una camera di imaging a otto pozzi. Immagini le celle usando un microscopio fluorescente standard a campo largo. Regolare le impostazioni di imaging per l'acquisizione dell'immagine.
Poiché gli aggregati 72Q sono molto più luminosi del segnale 25Q diffuso, è spesso necessario utilizzare un'impostazione di acquisizione diversa tra i diversi plasmidi al fine di evitare la saturazione del segnale fluorescente. Elaborare le immagini utilizzando un software di elaborazione delle immagini adatto. In questo protocollo, dot blot viene utilizzato per esaminare i livelli di espressione proteica.
Preparare il tampone per generare glisati proteici aggiungendo quattro micromolari di fluoruro di fenilmetilsulfonil e un cocktail inibitore della proteasi al tampone di lysis. Pellet cinque millilitri di ogni coltura notturna per centrifugazione. Sospendere di nuovo le celle in 200 microlitri di perline di vetro e 200 microlitri di tampone dilisi.
Vortice per 30 secondi per 12 round, ciliegina tra un round e l'altro. Centrifuga a 12.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti e raccogli il supernatante. Utilizzare un apparato di microfiltrazione per individuare uguali quantità di proteine totali su una membrana nitrocellulosa.
Pre-bagnare la membrana con PBS e assemblare l'apparecchio. Collegarlo a una fonte di vuoto e assicurarsi che le viti siano serrate. Caricare i campioni, accendere il vuoto e lasciare che il campione filtri attraverso la membrana per gravità.
Asciugare la membrana in PBS 05%Tween 5% latte senza grassi per 30 minuti. Incubare la membrana con anticorpi anti-flag primari a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con PBS 05%Tween.
Incubare la membrana con un anticorpo secondario etichettato fluorescentmente in PBS 05%Tween 5% latte privo di grassi a temperatura ambiente per un'ora. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con PBS 05%Tween. Successivamente, immagini la membrana utilizzando un sistema di documentazione amino macchia.
Il lievito che esprime esonero HTT 25Q o 72Q fuso a GFP monomerico ottimizzato per lievito o tag monomerico ottimizzato per lievito BFP2 è stato coltivato in glucosio o mezzo galattosio durante la notte e individuato su piastre di agar o incubato ulteriormente in mezzi liquidi. Mentre la supercartella monomerica ottimizzata per il lievito 72Q GFP induce un significativo difetto di crescita. L'etichetta monomerica ottimizzata per il lievito 72Q BFP2 mostra un fenotipo di crescita simile alle controparti 25Q non tossiche che indicano che la natura del tag fluorescente può impedire il comportamento di espansione del polyQ nelle cellule.
La valutazione dell'aggregazione delle fusioni poliQ fluorescenti mediante microscopia fluorescente mostra che la supercartella monomerica ottimizzata per il lievito 72Q GFP mostra un'aggregazione significativa, mentre il tag monomerico ottimizzato per il lievito 72Q BFP2 mostra un segnale citoplasmatico diffuso simile alle controparti 25Q non tossiche. Poiché i livelli di espressione delle varie fusioni poliQ potrebbero influire sulla tossicità, sono state eseguite macchie di punti per valutare i livelli proteici. Vengono mostrati i risultati di diluizioni cinque volte dei lire cellulari.
Non dimenticare che questa tecnica consente un rapido confronto delle proteine non caratteristiche e fluorescenti con le varianti GFP, ma non può valutare direttamente l'oligomerizzazione. Seguendo questa procedura, altre misure, ad esempio, il saggio dell'ulcera nelle cellule di mammifero possono essere eseguite per rispondere a domande aggiuntive come lo stato monomerico delle proteine fluorescenti.
