Name: experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory
Uploaded: 2018-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Esta publicación fue apoyada por una beca del Departamento de Educación (Premio PR #P031C160025-17, título del proyecto: 84,031 C) a las comunidades de Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) al compromiso de construir activos tallo (BASE C). Agradecemos a Zoología actual y Elsevier para proporcionar los derechos para utilizar los resultados representativos publicados en trabajos previos, así como los editores de Zeus por habernos brindado la oportunidad de publicar este protocolo. También nos gustaría agradecer al programa de BASE de C, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE y Departamento de biología, CSU-Pueblo), Departamento de Biología de CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Departamento de biología, Universidad de Skidmore) y la doctora Claire Varian Ramos (Departamento de biología, Colorado State University-Pueblo) por su apoyo y ayuda.

El siguiente protocolo es un protocolo experimental que se utiliza para criar especies en el género Drosophila en medio contaminado cuando la ingestión de una toxina es apropiada; otras formas de exposición son posibles usando Drosophila modelo11,15,16,26. Los métodos descritos en este protocolo se han descrito previamente por Hirsch et al. 19 y Peterson et al. 23 , 24 , 25.
1. establecer acciones poblaciones de Drosophila en el laboratorio de investigación
<ol><li>Establecer una incubadora ambientalmente controlado (o habitación) a poblaciones stock casa de Drosophila mediante el establecimiento de las incubadoras para una temperatura constante, ciclo luz: oscuridad y humedad, dependiendo de las preferencias de la especie estudiada. Nota: Recomendado: condiciones ambientales variarán según la ecología natural de la especie elegida para el estudio. Por ejemplo, D. melanogaster es nativo de África subsahariana27 y se mantiene normalmente a 25 ° C, 12:12 luz: oscuridad ciclo y aproximadamente 60% humedad16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. por otra parte, D. montana se extiende en la mayor parte de Canadá y los E.e.u.u. cercano oeste, una región mucho más frío; por lo tanto, montana D. normalmente se mantiene en 19 – 20 ° C y a veces un régimen de luz de 24 horas para simular las condiciones durante el acoplamiento de la temporada31. Para una descripción más detallada de las gamas geográficas de varias especies de Drosophila, ver los patrones de especiación de Drosophila Web32.</li>
	<li>
Obtener un recomendado: especies de Drosophila o línea consanguínea de ya sea un centro común (véase tabla de materiales), otro laboratorio de investigación sobre pedido o recoger salvaje, poblaciones genéticamente variables del campo. Nota: Los siguientes pasos explican los métodos para recoger las poblaciones silvestres, genéticamente variables de Drosophila para mantener en el laboratorio de investigación. Estos métodos se han modificado de Markow y O'Grady33 y Werner y Jaenike34 para recoger la más amplia diversidad de especies a la vez, en lugar de especies particular con una fuente de cebo.<ol>
<li>Congelar una docena plátanos maduros en el congelador durante la noche y descongelar antes de colocar las trampas de cebo.</li>
		<li>Prepare múltiples L 1-2 botellas de plástico cortando una abertura en forma de u en el frente de la botella para permitir que vuela ser capturado en la botella de cebo y no escape. Tapa las botellas de plástico con sus tapas de las botellas para que las moscas no se escapen a través de las tapas.</li>
		<li>Añadir el plátano descongelado a la parte inferior de las botellas para que la parte inferior de las botellas contiene aproximadamente una pulgada de plátano. Colocar una rodaja de tomate maduro en la botella. Añadir una mezcla de levadura (la levadura sobrante desde el proceso de elaboración de cerveza) para el plátano en la parte inferior de la botella para que el plátano es sumergirlo en la mezcla de levadura.</li>
		<li>Agregar los palillos de madera (en posición vertical vertical) a la botella para que las moscas tienen un substrato limpio a alejarse en la mezcla de levadura y plátano. La figura 1 muestra el producto final de estos métodos.</li>
		<li>Colgar carnada botellas en árboles durante la noche y comprobar que cada aspirada de boca 24 h. vuela fuera de botellas y colocar individualmente las hembras en frascos con medio de crear líneas de iso-mujer. Nota: Líneas múltiples femeninas pueden crear, sin embargo, sólo si las hembras de cada especie pueden ser claramente identificadas. Además, vuela dentro del género Drosophila ocupa nichos ecológicos diferentes y tendrá diferentes necesidades dietéticas dependiendo de esos nichos (Werner y Jaenike34); Ver Werner y Jaenike34 recomendaciones de dieta y recetas de comida.</li>
		<li>Examinar la descendencia de1 F adulto bajo el microscopio de disección para identificar la especie de la recogida de Drosophila (véase Markow y O'Grady33 y34 del Werner y Jaenike para asistencia en la identificación de varias especies ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Figura 1 : Representación pictórica de trampas y cebos utilizados para recoger las poblaciones silvestres de Drosophila en el campo. (A) mosca atrapa el conjunto en un sitio de campo local en Colorado. (B) una vista más cercana de la mosca atrapa el sistema en este sitio de campo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="3"><li>Mantener la hembra iso o las líneas múltiples femeninas en una incubadora controlada ambientalmente o una habitación con temperatura constante, el ciclo luz: oscuridad y humedad. Para ello, casa vuela en frascos o botellas en prefirieron medio y permitir que las hembras grávidas ponen huevos en el medio. Vigilar los frascos de la presencia de larvas y pupas. Nota: Moscas dentro del género Drosophila ocupan nichos ecológicos diferentes y tienen diferentes necesidades dietéticas y preferencias abióticos ambientales dependiendo de esos nichos33,34. Preferencias ambientales y recomendaciones dietéticas (y más instrucción en la cría de mosca) se pueden encontrar en Elgin y Miller28, Shaffer et al. 29, stocker y Galán30, Markow y o ' Grady33y Werner y Jaenike34. Si utiliza especies capturados, las condiciones ambientales locales pueden ser simuladas en las incubadoras hasta que la especie puede ser identificada.</li>
	<li>Transferencia de acciones con frecuencia a medio fresco, descarte frascos antiguos, para mantener líneas saludables y evitar la infección de ácaros. Nota: La frecuencia de transferencia dependerá del ciclo de vida de la especie. Por ejemplo, transferencia de Drosophila melanogaster cada 2 semanas a medio fresco. Para más información sobre mantenimiento de líneas en el laboratorio, vea Rand et al. 16, Elgin y Miller28, Shaffer et al. 29, stocker y Galán30, Greenspan35y Ciencias de la educación36de base de datos.</li>
</ol>2. parte posterior de Drosophila en el medio contaminado
Nota: Si pruebas de Drosophila en el laboratorio por primera vez o con un nuevos contaminantes, determinar la dosis letal (véase Castañeda et al. 37 y Massie et al. 38 métodos) y la DL50 (ver Castañeda et al. 37 y Akins et al. 39 métodos) primera. A continuación, ejecute una curva dosis-respuesta para identificar concentraciones biológicamente relevantes para la deseada salida fenotípica; Ver Hirsch et al. 19 y Zhou et al. 40 para los métodos.
<ol><li>Preparar las soluciones madre del medio contaminado en el deseado concentraciones, dependiendo de la química del contaminante. Nota: por ejemplo, para preparar las soluciones madre de PbAc: preparar soluciones de acetato de plomo (PbAc) medio agregando contaminantes al agua destilada (dH20) hasta medio hecho con agua de contaminante alcanza concentración deseada. Por ejemplo, una solución madre de 1.000 μm PbAc, puede ser preparado agregando PbAc a dH20 hasta llegar a 1.000 μm PbAc. Además, diluir la solución (por ejemplo, los 1.000 solución del PbAc de μm) hasta la concentración deseada (como 500 μm PbAc) y mantener estas soluciones como así.</li>
	<li>Preparar el medio, las pautas del fabricante siguientes para servir como medio de control. Preparar medio adicional, las directrices del fabricante siguientes; sin embargo, suplemento contaminantes solución preparada para dH20. Nota: por ejemplo, si utiliza un instante medio Drosophila , agregar aproximadamente una cucharada medio instantáneo a un frasco de plástico. Añadir aproximadamente 5 – 5.5 mL dH20 a la media. Esparcir algunos granos de levadura viva para preparar el medio de control. Para preparar el medio experimental, complementar la solución (como 500 μm PbAc) para dH20.</li>
	<li>
Transferencia viables reproductivamente maduros machos y hembras de las poblaciones comunes en el control y el experimental medio. Nota: La eclosión posterior de tiempo a la madurez reproductiva es diferente entre las especies Drosophila del41.<ol>
<li>Golpee suavemente el frasco de las moscas comunes hacia abajo con la mano dominante. Asegúrese de que las moscas se desplazan automáticamente a la parte inferior del frasco. Con la otra mano, retire la tapa del frasco al golpear ligeramente el frasco y colocar un vial nuevo de control o medio contaminado en la parte superior del frasco con las moscas. Mantenga los frascos juntos y voltearlas, golpear ligeramente suavemente, para que las moscas automáticamente se transfieren al frasco de dulce de control o medio contaminado. Mientras todavía golpear ligeramente el frasco con las moscas, tapa el frasco.</li>
		<li>Repita con viales más, asegurándose de que estandarizar el número de moscas en cada frasco. Nota: El número total de adultos había transferido a a través de una transferencia o anestesia dependerá del tamaño de los frascos para evitar hacinamiento.</li>
		<li>Incubar a adultos en condiciones ambientales estándar (es decir, una incubadora) y permitir que los adultos se aparean y ponen huevos en el medio de 24-96 h.</li>
		<li>Después de 24-96 h, descartar adultos en un depósito de cadáveres (un frasco lleno de aceite mineral y tapado con un embudo ajustada) dejando tras de sí fertilizan huevos (que más tarde se convierten en los sujetos experimentales) para madurar durante la prueba. Coloque los frascos en la incubadora para permitir que los huevos se desarrollan.</li>
		<li>Vigilar los frascos para larvas de estadio que vaga buscando las larvas que emergen del medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. recolectar a sujetos experimentales en diversas etapas del desarrollo
Nota: Sujetos experimentales pueden ser recogidos en cualquier etapa del desarrollo, situado en el ciegos codificados tubos cónicos de 15 mL y probado para la acumulación. Métodos de prueba de la acumulación de contaminantes dependerá del contaminante en estudio. Por ejemplo, acumulación de PbAc puede probarse usando Inductively-Coupled espectrometría de Plasma (ICP-MS)42. Además, sujetos experimentales pueden ser recogidos en cualquier etapa del desarrollo a probar para una variedad de efectos fenotípicos de los contaminantes. La figura 2 ilustra el ciclo de vida de Drosophila 43. La figura 3 ilustra el protocolo experimental para la exposición y las diferentes etapas de desarrollo de colección.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Figura 2 : Resumen conceptual del ciclo de vida de D. melanogaster (el más utilizado sistema de modelo de Drosophila ). Las etapas del ciclo de vida de la Drosophila son: 1) huevo, 2) primer estadio larva, larva de segundo estadio de 3), 4) tercera-instar de la larva, 5) por la larva de tercer estadio, pupa 6) White-Eye, pupa 7) rojos, 8) recién-eclosed adulto y adulto 9) maduro. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Figura 3 : Resumen conceptual de los métodos para la exposición oral de Drosophila al medio contaminado en el parental (F0) y generaciones posteriores (F1 y). (A) métodos de exposición oral durante el desarrollo en la generación expuesta. (B) métodos para probar a la transferencia de contaminantes a la descendencia (F1 , a la generación deseada). Esta figura ha sido modificada de Peterson et al. 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol><li>
Recoger larvas errantes-tercer estadio
	<ol>
<li>Comience a controlar los frascos cuando se enciende en la incubadora, ya que las larvas se emerge desde el medio y mover hacia arriba en el lado el frasco dentro de una horas después de que se enciende en la incubadora. Dentro de este h, quitar las larvas de estadio de tercera vagar por los lados de la cubeta con cuidado utilizando un palito de madera o pinzas. Nota: El número de larvas disponibles para la recogida dependerá de la cantidad de huevos puestos en "2.3.4".</li>
		<li>Para quitar el exceso medio de las larvas, coloque las larvas en un pequeño vaso con dH2O. Pour la dH2O fuera del vaso y coloque las larvas en un limpiador de tarea delicada. Usando un limpiador de tarea delicada, suavemente Quite el exceso de dH2O de las larvas.</li>
		<li>Mantener poblaciones experimentales en una incubadora con ambiente controlado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recoger nuevamente eclosed adultos
	<ol>
<li>Viales de monitor para eclosión mediante la observación de la coloración de las pupas a lo largo de los lados de los frascos. Nota: Pupas se oscurecerán durante el desarrollo. Tiempo de desarrollo, particularmente de la eclosión, depende de las especies probadas.</li>
		<li>Cuando los primeros adultos eclose, volcado y deseche a estos adultos en una morgue que contiene aceite mineral.</li>
		<li>Cuando la luz se prende en la incubadora a la mañana siguiente, la descarga y descartar a cualquier adulto de edad desconocida (o virginidad) que tenga eclosed durante la noche o durante las luces morningbefore en.</li>
		<li>Aproximadamente 4 h más tarde, anestesiar cualquier adulto que recién eclosed adultos con una pistola de CO2 en los frascos. Lugar de adultos en una placa de2 CO bajo un microscopio de disección. Adultos sexo buscando sexo peines en los miembros anteriores de los machos y huevecillos de las hembras. Nota: D. melanogaster deberán recogerse dentro de las 6 h de eclosión para evitar el apareamiento pero otras especies pueden tener más desarrollo veces (y por lo tanto, no es necesario ser recogidos dentro de este marco de tiempo).</li>
		<li>Adultos separados en la placa de CO2 utilizando un palo de madera. Suavemente la transferencia de adultos en grupos específicos de sexo usando un palo a la media historia preexistente que empareja.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recoger la eclosión de adultos maduros
	<ol>
<li>Permitir que adultos en la medio exposición correspondiente antes de la eclosión de la etapa de huevo a la eclosión posterior de edad deseada en una incubadora con ambiente controlado.</li>
		<li>Solo transferencia de adultos en el medio de control de 24 h antes de la prueba para permitir a adultos para exceso medio contaminado sus cuerpos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. sujetos experimentales para probar los efectos de múltiples generaciones o la exposición del Transgenerational de la trasera.
<ol><li>Posterior a la generación parental (a.k.a el P0 e F0 generación), transferencia de adultos de poblaciones acciones para el control y el experimental medio siguiendo los pasos de "2.1" "2.3" y "3.1" para "3.3".</li>
	<li>Cuando los adultos están reproductivamente maduros (ver Pitnick et al. 41), solo un frasco de machos a un vial nuevo de control o medio experimental de transferencia (según lo indicado en 2.3.1). Solo transferencia de un vial de hembras al frasco de dulce que contiene ahora los machos. Permitir que a adultos mate y endecha huevos en el medio de 24-96 h. descarga y deseche a adultos en un depósito de cadáveres que contengan aceite mineral y volver a incubar viales para permitir que los hijos a desarrollar.</li>
	<li>Repita los pasos 4.1 a 4.2 según el número de generaciones.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Drosophila melanogaster se ha establecido como un poderoso modelo para una variedad de procesos biológicos debido a la amplia conservación de genes y rutas de D. melanogaster y los seres humanos13,14. Por las mismas razones que es un potente modelo para la ciencia médica, la Drosophila ha surgido como modelo adecuado para estudiar el impacto de la contaminación antropogénica en una gama de puntos finales toxicológicos. Varios labo...

Cada año, aproximadamente 1.000 nuevos productos químicos son introducidos por la industria química1,2; sin embargo, los impactos ambientales de sólo un pequeño porcentaje de estos productos químicos son probados antes de distribución2,3. Aunque catástrofes a gran escala son poco comunes, subletal y crónica de la exposición a una gran variedad de contaminantes están muy extendidos en los seres humanos y vida silvestre4,5. El enfoque histórico de toxicología ambiental y Ecotoxicología fue probar la mortalidad, sola exposición a sustancias químicas, la exposición aguda y los efectos fisiológicos de la exposición, como un medio de medir el impacto de los contaminantes sobre supervivencia6, 7 , 8 , 9 , 10. aunque hay un cambio hacia enfoques éticos y no invasivo para los ensayos con animales, enfoques actuales limitan debido al papel que desarrollo, propiedades emergentes y factores externos (como el nivel de población y interacciones a nivel de ecosistema) juegan en la mediación de extremos importancia ecológica8. Por lo tanto, hay una necesidad de métodos que incorporan un enfoque más holístico sin sacrificar la vida silvestre y vertebrados en el laboratorio.
Los sistemas modelo de invertebrado, como Drosophila melanogaster, son una atractiva alternativa para abordar la necesidad de un enfoque más holístico para ensayos de toxicidad. D. melanogaster, fue originalmente desarrollado como un sistema modelo de invertebrado para humanos relacionados con la investigación genética sobre hace un siglo11. D. melanogaster ahora prominente se utiliza como una alternativa de modelo vertebrados por varias razones: 1) la conservación de genes y rutas entre D. melanogaster y los seres humanos; 2) tiempo de generación corta en comparación con los modelos de vertebrados; 3) costo bajo costo de mantenimiento; 4) facilidad en la generación de tamaños de muestra grandes; y 5) gran cantidad de puntos finales fenotípica y ecológica-relevante disponibles para la prueba11,12,13,14,15,16,17 .
Varios laboratorios11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 ahora utilizan D. melanogaster como una alternativa de modelo vertebrados para ensayos de toxicidad para entender los impactos de la contaminación en los seres humanos. Especies silvestres de Drosophila pueden ser utilizadas, así como modelos de toxicidad para la fauna (y humanos) responder a ecológico-, su comportamiento-y evolutivamente relevantes cuestiones en múltiples niveles biológicos de organización. Utilizando especies dentro del género Drosophila como modelo, varios criterios de valoración cuantificables son posibles11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, utilizando el modelo de Drosophila , toxicólogos pueden: 1) enlace éticamente efectos en múltiples niveles biológicos de la organización; 2) incorporar el papel de los factores emergentes y desarrollo; 3) estudio de extremos ecológicamente importantes (además de extremos médicamente importantes); 4) prueba de estresores múltiples simultáneamente. 5) y prueba a largo plazo multigeneracional (e.g. evolutiva y transgeneracional) implicaciones de estresores. Por lo tanto, usando Drosophila como sistema modelo permite una multitud de enfoques, que no se limita a estudiar los enfoques mecanicistas con cepas endogámicas de D. melanogaster en el laboratorio.
En este trabajo, presentamos los métodos para la cría y recolección de Drosophila para responder diversas cuestiones toxicológicas. Más específicamente, se describe la metodología para 1) cría de Drosophila en medio con uno o más contaminantes; 2) recogida de Drosophila en desarrollo (p. ej. larvas de tercer estadio pupas casos, recién eclosed adultos y adultos maduros que vaga); y 3) cría de Drosophila en el medio contaminado a prueba intergeneracional y transgeneracional transmisión, así como implicaciones evolutivas de la exposición a largo plazo de sustancias tóxicas. Usando este protocolo, los anteriores autores18,19,20,21,22,23,24,25 han publicado diferentes efectos fisiológicos, genéticos y conductuales del desarrollo (Pb2 +) exposición al plomo. Este protocolo permite toxicólogos utilizar un enfoque más holístico de toxicológico, que es esencial para entender cómo los contaminantes son factores de riesgo para los seres humanos y vida silvestre en un ambiente cada vez cada vez más contaminado.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Propiedades emergentes y factores externos (interacciones a nivel de población y ecosistema, en particular) desempeñan importantes funciones en la mediación de las terminales de importancia ecológica, aunque se consideran raramente en estudios toxicológicos. D. melanogaster se perfila como un modelo de toxicología para el impacto conductual, neurológico y genético de sustancias tóxicas, para nombrar unos pocos. Más importante aún, se pueden utilizar especies en el género Drosophila como sistema modelo para un enfoque marco integrador incorporar propiedades emergentes y responder preguntas ecológicamente relevantes en la investigación de Toxicología. El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes para ser utilizado como sistema modelo para una gama de salidas fenotípicas y ecológicamente pertinentes preguntas. Más específicamente, este protocolo permite 1) enlazar múltiples niveles biológicos de organización y entender el impacto de sustancias tóxicas en ambos fitness nivel de individuo y población; 2) prueba el impacto de sustancias tóxicas en las diferentes etapas de la exposición del desarrollo; 3) consecuencias multigeneracionales y evolutivo prueba de contaminantes; y 4) probar simultáneamente múltiples contaminantes y estresantes.

Exponiendo oralmente Drosophila a contaminantes en todo el desarrollo, se pueden probar diversas cuestiones toxicológicas exponiendo Drosophila en los diferentes niveles de organización biológica. Esta sección presenta resultados representativos obtenidos utilizando este protocolo en artículos previamente publicados23,24. En particular, este protocolo fue utilizado previamente para evaluar la acumulación, l...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

En este trabajo, proporcionamos un protocolo detallado para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes con el objetivo de estudiar el impacto de la exposición en un rango de salidas fenotípicas en diferentes etapas de desarrollo y para más de una generación.

Protocolo experimental para el uso de Drosophila como sistema modelo de invertebrado para ensayos de toxicidad en el laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K vistas.  Colorado State University-Pueblo. En este trabajo, proporcionamos un protocolo detallado para la exposición de especies en el género Drosophila a contaminantes con el objetivo de estudiar el impacto de la exposición en un rango de salidas fenotípicas en diferentes etapas de desarrollo y para más de una generación.

Video: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Investigación

Neurociencias

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para probar la interrupción endocrina en Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Biología del Desarrollo

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Ensayo Preferencia gusto por adulto<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Inmunología e Infección

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Un modelo de lesión de Drosophila en Vivo para el estudio de Neurorregeneración en el periférico y sistema nervioso Central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Biología

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Evaluación de la toxicidad química en adultos Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Lifespan Protocol for Drosophila melanogaster: Generating Survival Curves to Identify Differences in Fly Longevity

Source: Bovier, T. F., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59535/" target="_blank">Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan protocol to measure how different experimental conditions affect flies&#39; longevity and generate survival curves in the process to quantify the experimental outcomes. The sample protocol features the assay being applied to study the effects on longevity from exposure to varying concentrations of endocrine disruptor chemicals, or EDCs, such as 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2).

Protocolo de esperanza de vida para Drosophila melanogaster: generación de curvas de supervivencia para identificar diferencias en la longevidad de la mosca

Source: Bovier, T. F., et al. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan ...