Name: experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory
Uploaded: 2018-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Bu yayın bir hibe Department of Education tarafından desteklenmiştir (PR Ödülü #P031C160025-17, proje başlığı: 84.031 C) etkin kök inşa nişan (C-BASE) için Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) topluluklarına. Geçerli zooloji teşekkür ederiz ve bize bu protokolü yayımlamak için bir fırsat sağlamak için Jüpiter editörleri yanı sıra önceki kağıtları temsilcisi sonuçları kullanma hakkı sağlamak için Elsevier yayınladı. Ayrıca C-Bankası programı, Dr Brian Vanden Heuvel (C-taban ve Biyoloji bölümü, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo biyoloji bölüm, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Biyoloji bölümü, Skidmore üniversite) ve Dr. Claire Varian Ramos teşekkür etmek istiyorum (Biyoloji bölümü, Colorado State University-Pueblo) onların destek ve yardım için.

Bir toksin ağız sindirim uygun olduğunda kirli ortamda Drosophila cins içinde tür arka için kullanılan deneysel bir iletişim kuralı aşağıdaki protokoldür; maruz kalma diğer formları Drosophila modeli11,15,16,26kullanarak mümkündür. Daha önce Hirsch ve ark. tarafından açıklanan bu protokol için açıklanan yöntemleri 19 ve Peterson vd. 23 , 24 , 25.
1. Araştırma Laboratuvarı Drosophila hisse senedi olasılığını ayarla
<ol><li>Çevre kontrollü inkübatör (veya küçük oda) Drosophila ev hisse senedi nüfus için İnkübatörler ayarlayarak sabit sıcaklık, ışık: karanlık döngüsü ve nem, test türler tercihleri bağlı olarak ayarlayın. Not: Tercih edilen çevre koşulları çalışma için seçilen türlerin yerel ekoloji bağlı olarak değişir. Örneğin, D. melanogaster Sahra Afrika27 ile yerel ve 25 ° C, 1212: açık: koyu döngüsü ve yaklaşık % 60 nem16,18,19,20 genellikle korunur , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. öte yandan, Kanada ve midwest ABD'de bir soğuk kadar bölge; en boyunca D. montana aralığı genişletir Bu nedenle, D. montana genellikle koşulları sırasında çiftleşme sezonu31benzetimini yapmak için 19-20 ° C ve bazen 24 h ışık rejimi tutulur. Drosophilaçeşitli türlerin coğrafi aralıkları daha ayrıntılı açıklaması için bkz: Drosophila türleşme desenler Web sitesi32.</li>
	<li>
Bir tercih edilen Drosophila türler ve/veya doğuştan çizgi ya da bir hisse senedi Merkezi'nden (bkz. tablo reçetesi) alanından isteği veya toplamak çıldırdı, genetik olarak değişken nüfus üzerine başka bir araştırma laboratuvarı. Not: Aşağıdaki adımlarda araştırma laboratuvarı korumak için Drosophila vahşi, genetik olarak değişken nüfus toplamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemler Markow ve O'Grady33 ve Werner ve Jaenike34 geniş çeşitlilik türlerin bir kerede bir yem kaynağı ile hedef belirli türler yerine toplamak için değiştirilmiş.<ol>
<li>Buzlukta yarım düzine olgun muz gecede donma ve yem tuzakları ayarlamadan önce defrost.</li>
		<li>Birden fazla 1-2 L plastik şişe şişe sinekler yem şişe ve kaçış yakalanması izin vermek için önünde u şeklinde bir yarık keserek hazırlayın. Sinekler kapakları kaçamaz Yani plastik şişe onların şişe kapakları ile kap.</li>
		<li>Böylece şişelerin dibinde yaklaşık bir inç muz içerir fetişlerin muz şişeleri altýna ekleyin. Ripe domates bir dilim şişeye koyun. Böylece Maya Bulamaç emmek muz alır bir Maya Bulamaç (artık Maya bira verme süreci üzerinden) şişenin dibinde muz ekleyin.</li>
		<li>Maya bulamaç ve muz uzak üzerinde yürümek için temiz bir substrat sinekler var ve bu yüzden (içinde dikey dik) ahşap sopa için şişe ekleyin. Bu yöntemlerden nihai ürün Şekil 1 gösterir.</li>
		<li>Ağaçlar şişelerde bir gecede ve her 24 h ağız aspiratı şişe dışında uçar kontrol yem asmak ve şişeleri ISO-erkek satırları oluşturmak için orta ile tek tek kadın yer. Not: Eğer sadece her tür dişilerini açıkça belirlenebilir çok kadın satırlar, ancak, oluşturulabilir. Buna ek olarak, sinekler Drosophila cins içinde farklı ekolojik niş işgal ve bu niş (Werner ve Jaenike34); bağlı olarak farklı beslenme ihtiyaçları olacak Werner ve Jaenike34 diyet önerileri ve yemek tarifleri için bkz.</li>
		<li>Toplanan Drosophila türler tanımlamak için belgili tanımlık yetişkin F1 çoluk çocuk diseksiyon mikroskop altında incelemek (Markow ve O'Grady33 ve Werner ve Jaenike34 çeşitli türler belirleme konusunda yardım için bkz: ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Resim 1 : Tuzaklar ve yem Drosophila alanında vahşi nüfus toplamak için kullanılan resimsel gösterimi. (A) sinek küme Colorado'da bir yerel alan sitede yakalar. (B) daha yakın görünümünü anında küme bu alan sitede yakalar. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol start="3"><li>ISO-erkek ya da bir çevre kontrollü inkübatöre veya oda sabit sıcaklık, ışık: karanlık döngüsü ve nem ile çok kadın satırlarında sürdürür. Bunu yapmak için ev şişeleri uçan veya şişelerde orta tercih ve ortamda yumurtlamak gravid kadın izin. Şişeleri larva ve pupa varlığı için izleyin. Not: Sinekler Drosophila cins içinde farklı ekolojik niş işgal ve farklı diyet gereksinimleri ve bu nişler33,34bağlı olarak çevre abiyotik Tercihler olacaktır. Çevresel tercihleri ve diyet önerileri (ve daha fazla sinek yetiştirme eğitimi)-ebilmek bulunmak Elgin ve Miller28, Shaffer ve ark. 29, stocker ve Gallant30, Markow ve O'Grady33ve Werner ve Jaenike34. Belgili tanımlık tür-ebilmek var olmak identified kadar yerel çevre koşulları vahşi yakalanan türleri kullanıyorsanız, İnkübatörler benzetimi yapılabilir.</li>
	<li>Hisse senetleri, sık sık taze orta aktarımı, sağlıklı satırları korumak için eski şişeleri, atma ve akarları enfeksiyondan kaçının. Not: Aktarım sıklığını türlerin yaşam döngüsü bağlı olacaktır. Örneğin, Drosophila melanogaster 2 haftada taze ortamına aktarın. Daha fazla bilgi üzerinde laboratuvarda, satırları korumak için Rand ve arkgörmek. 16, Elgin ve Miller28, Shaffer ve ark. Veritabanı36 29, stocker ve Gallant30, Greenspan35ve Fen eğitimi.</li>
</ol>2. arka Drosophila kirlenmiş orta
Not: İlk kez veya yeni bir contaminant(s) ile laboratuvar olarak Drosophila sınama olumlu sonuçlanırsa, öldürücü doz tanımlamak (bkz: Castaneda vd. 37 ve Massie vd. 38 yöntemleri için) ve LD50 (Castaneda ve arkbkz. 37 ve Akins ve ark. 39 yöntemleri için) ilk. Daha sonra istediğiniz fenotipik çıktı için biyolojik ilgili konsantrasyonları tanımlamak için bir doz-yanıt eğrisi çalıştırın; Hirsch ve arkgörmek. 19 ve Zhou ve ark. 40 yöntemleri için.
<ol><li>Kirlenmiş orta kirletici Kimya bağlı olarak istenen concentration(s), hisse senedi çözümleri hazırlayın. Not: Örneğin PbAc hisse senedi çözümler hazırlamak için: geçen madde su ulaşır istenen konsantrasyon ile yapılan orta kadar distile su (dH20) geçen madde ekleyerek Kurşun asetat (PbAc) orta hisse senedi çözümleri hazırlayın. Örneğin, 1000 µM hisse senedi bir çözüm PbAc, hazır 1000 µM ulaşıncaya kadar dH2için 0 PbAc ekleyerek PbAc. Ayrıca, stok çözüm (Örneğin 1000 µM PbAc çözüm) için istenen konsantrasyon seyreltik (500 µM gibi PbAc) ve bu çözümler de hisse senedi korumak.</li>
	<li>Orta, denetim aracı olarak hizmet vermek amacıyla aşağıdaki üreticisinin yönergeleri hazırlamak. Ek orta, aşağıdaki üreticisinin yönergeleri hazırlamak; Ancak, hazırlanan kirletici çözüm dH20 için ek. Not: Örneğin, bir anda Drosophila orta kullanıyorsanız, yaklaşık bir çay kaşığı anlık orta için plastik bir şişe ekleyin. Yaklaşık 5-5,5 mL dH20 orta olarak ekleyin. Bir kaç canlı baker kontrol ortamı hazırlamak için mayası taneleri serpin. Deneysel orta hazırlamak için hisse senedi çözüm ek (500 µM gibi PbAc) dH20.</li>
	<li>
Çoğalma uygun Olgun kadın ve erkek hisse senedi örneğin alınma olasılığını denetimi ve deneysel orta aktarın. Not: Saat sonrası eclosion üreme vade arasında Drosophila türler41farklıdır.<ol>
<li>Nazikçe hisse senedi sinekler şişe aşağı dominant el ile dokunun. Sinekler otomatik olarak şişe altına taşımak emin olun. Diğer el ile şişe dokunarak süre şişe kapağını çıkarın ve denetim veya kontamine orta taze bir şişe şişeyi sinekler ile üstüne yerleştirin. Şişeleri bir arada tutmak ve sinekler otomatik olarak denetim veya kontamine orta taze şişe aktarılır böylece onları hafifçe dokunarak, ters çevirin. Hala şişeyi sinekler ile dokunarak süre, şişeyi kap.</li>
		<li>Her şişe sinekli sayısı standartlaştırmak emin olmak daha fazla şişeleri ile yineleyin. Not: Yetişkinlerin tek transfer yoluyla aktarılan toplam ya da anestezi aşırı kalabalık önlemek için kullanılan şişeleri boyutuna bağlıdır.</li>
		<li>Yetişkin bir standart çevre koşulu (yani bir kuluçka)'nda kuluçkaya ve yetişkinler dostum ve orta 24-96 h için yumurtalarını bırakmak için izin verir.</li>
		<li>24-96 h sonra yetişkin bir morg (mineral yağ ile dolu ve dar huni ile şapkalı bir şişesi) atmak geride bırakarak test etmek için olgun için (daha sonra deneysel konular olacak) yumurta döllenmiş. Tüpleri yumurta geliştirmek izin vermek için kuluçka makinesine koyun.</li>
		<li>Göçebe-biçim larva için şişeleri ortamından çıkan larvalar bakarak izlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. toplamak deneysel konularda çeşitli gelişim aşamalarında
Not: Deneysel konularda kör kodlanmış 15 mL konik tüpler içinde yerleştirilir ve birikimi için test herhangi bir aşamada gelişimsel toplanan olabilir. Kirletici madde birikimi sınama yöntemleri okudu kirletici bağlı olacaktır. Örneğin, PbAc birikimi Inductively-Coupled plazma kütle spektrometresi (ICP-MS)42kullanarak test edilebilir. Buna ek olarak, gelişimsel herhangi bir aşamada fenotipik kirletici etkileri çeşitli için test edilecek deneysel konularda toplanan olabilir. Şekil 2 Drosophila yaşam döngüsü43göstermektedir. Şekil 3 pozlama için deneysel protokol ve koleksiyon için farklı gelişim aşamalarında gösterilmektedir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Resim 2 : D. melanogaster (en sık kullanılan Drosophila modeli sistemi) yaşam döngüsünün kavramsal genel bakış. Drosophila yaşam döngüsünün aşamaları vardır: 1) yumurta, 2) ilk biçim larva, 3) ikinci biçim larva, 4) üçüncü INSTAR larva, 5) üçüncü-biçim larva, göçebe 6) white-eye pupa, 7) kırmızı göz pupa, 8) yeni-eclosed yetişkin ve 9) olgun yetişkin. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Şekil 3 : Sözlü olarak kontamine orta ebeveyn (F0) ve sonraki nesillere Drosophila teşhir için yöntemler kavramsal genel bakış (F1 ve aynı zamanda). (A) yöntemleri maruz üretimi geliştirme sırasında sözlü maruz kalma. (B) yöntemleri kirletici maddeleri transfer çoluk çocuk (F-1 istenen üretimi) için test etmek için. Bu rakam Peterson ve ark. değiştirildi 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<ol><li>
Göçebe-üçüncü INSTAR larva toplamak
	<ol>
<li>Larva ortamından ortaya ve kuluçka makinesine ışıkları açın sonra şişenin içinde bir h tarafında yukarı taşımak gibi ışıklar da kuluçka makinesine açtığınızda şişeleri izleme başlatın. İçinde bu h, göçebe-üçüncü INSTAR larva dikkatle bir tahta sopa veya cımbız kullanarak şişe taraftan kaldırmak. Not: "2.3.4" koydu yumurta sayısı larva koleksiyonu için kullanılabilir sayısını bağlıdır.</li>
		<li>Aşırı orta larvaları kaldırmak için dH2O. Pour dH2O kabı dışında küçük bir ölçek larvalar yerleştirin ve larvalar hassas görev silecek yerleştirin. Hassas görev silecek kullanarak, larvaları aşırı dH2O yavaşça çıkarın.</li>
		<li>Çevre kontrollü bir kuluçka deneysel nüfusu korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yeni eclosed yetişkin toplamak
	<ol>
<li>Şişeleri için eclosion şişeleri kenarlarında pupa coloration gözlemleyerek izlemek. Not: Pupa geliştirme sırasında koyulaştırır. Gelişimsel zaman, özellikle ön eclosion, test türler üzerinde bağlıdır.</li>
		<li>İlk yetişkin eclose için başladığınızda, terk ve bu yetişkinlerin madeni yağ içeren bir morg atın.</li>
		<li>Ertesi sabah da kuluçka makinesine ışıkları açmak zaman, terk ve gecede veya morningbefore ışıkları sırasında eclosed sahip olabilir herhangi bir yetişkin bilinmeyen yaş (veya bekaret) atın.</li>
		<li>Yaklaşık 4 saat sonra anestezi CO2 topu şişeleri bulunan yeni eclosed yetişkin olarak ortaya çıkan herhangi bir yetişkin. Yetişkin bir diseksiyon mikroskop altında bir CO2 tabak yerleştirin. Yetişkin erkek ve kadın ovipositors ön ayakları üzerinde seks tarak yaşar seks. Not: D. melanogaster çiftleşme önlemek için eclosion içinde 6 h toplanan gerekir, ancak diğer türler artık gelişimsel kez olabilir (ve bu nedenle, bu zaman dilimi içinde toplanmasına gerek yoktur).</li>
		<li>Tahta bir sopa kullanarak CO2 plaka üzerinde ayrı yetişkin. Yavaşça orta eşleşen önceden varolan geçmiş için tahta bir sopa ile seks özel grupları yetişkinlerde aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Olgun yetişkin sonrası eclosion toplamak
	<ol>
<li>Yetişkin orta eşleşen öncesi eclosion maruz yumurta aşamasından bir çevre kontrollü kuluçka istenilen yaş sonrası eclosion üzerinde kalmasını sağlar.</li>
		<li>Degişmeyen tek yetişkin yetişkin kapalı bedenlerini aşırı kirlenmiş orta damat izin vermek için test önce 24 saat denetim orta aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. arka deneysel konularda Multigenerational etkileri ve Transgenerational pozlama Test etmek.
<ol><li>Ebeveyn üretimi (aka P0 veya F0 nesiller) arka için yetişkin "2.1" anlatılan adımları izleyerek deneysel orta ve denetlemek üzere hisse senedi nüfus "2.3" ve "3.1" "3.3" için transfer.</li>
	<li>Ne zaman yetişkin çoğalma Olgun (Pitnick ve arkbkz. 41), tek başına, denetim ya da deneysel orta taze bir şişe için erkek (2.3.1 belirtildiği gibi) transferi bir şişe. Tek başına bir şişe kadın erkek şimdi içeren taze şişe aktarın. Yetişkin dostum ve lay yumurta ortamda 24-96 h. dökümü için izin ve yetişkin madeni yağ içeren bir morga atın ve şişeleri yavru geliştirmek izin vermek için yeniden kuluçkaya.</li>
	<li>4.1 4.2 nesiller istenen sayısına bağlı olarak aracılığıyla adımları yineleyin.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Drosophila melanogaster genler ve13,14 D. melanogaster ve insanlar arasında yollar geniş korunması nedeniyle biyolojik süreçlerin bir dizi için güçlü bir model olarak kurulmuştur. Tıp bilimi için güçlü bir model olduğunu aynı nedenlerle Drosophila toksikolojik bitiş noktaları bir dizi antropojenik kirlilik etkisi çalışma için uygun modeli sistem olarak ortaya çıkmıştır. Birkaç laboratuar başarıyla D. m...

Her yıl yaklaşık 1000 yeni kimyasallar kimya endüstrisi1,2tarafından tanıtıldı; Ancak, sadece küçük bir yüzdesi bu kimyasalların çevreye etkilerinin dağıtım2,3önce test edilir. Büyük ölçekli felaketler nadir olmakla birlikte, kirleticiler, büyük bir çeşitlilik sublethal ve kronik maruz insanlar ve yaban hayatı4,5yaygın. Ölümcül, tek kimyasal pozlama, akut maruz kalma ve pozlama, fizyolojik etkileri kirleticiler hayatta kalma6, etkisini ölçme aracı olarak test etmek için ecotoxicology ve Çevresel Toksikoloji tarihsel odak oldu 7 , 8 , 9 , 10. hayvan testi için etik ve non-invaziv yaklaşımlar doğru bir kayma olsa da, geçerli yaklaşımlar rolden dolayı bu geliştirme, acil özellikleri ve dış faktörler sınırlama var (nüfus düzeyi gibi ve ekosistem düzeyi etkileşimleri) ekolojik önemli bitiş noktaları8arabuluculuk oynamak. Bu nedenle, yaban hayatı ve/veya laboratuarda omurgalılar ödün vermeden daha bütünsel bir yaklaşım dahil yöntemleri için bir ihtiyaç vardır.
Omurgasız modeli, Drosophila melanogastergibi toksisite test daha bütünsel bir yaklaşım ihtiyacını gidermek için cazip bir alternatif sistemlerdir. D. melanogaster, orijinal bir omurgasız modeli sistemi hakkında bir asır önce genetik araştırma insan ile ilgili olarak gelişmiş11. D. melanogaster şimdi göze çarpacak şekilde kullanılır omurgalı modeli alternatif bir yöntem olarak çeşitli nedenlerle: 1) koruma genler ve yolları arasında D. melanogaster ve insanlar; 2) kısa oluşturma süresi omurgalı modellerle karşılaştırıldığında; 3) ucuz maliyet, bakım; 4) örneklerin boyutu büyük oluşturmak için kolay; ve 5) fenotipik ve ekolojik-ilgili bitiş noktaları11,12,13,14,15,16,17 test etmek için kullanılabilir bolluk .
Birkaç laboratuar11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 artık kullanıyor D. melanogaster omurgalı modeli alternatif bir yöntem olarak toksisite testleri için kirliliği insanlar üzerinde etkileri anlamak için. Drosophila yerel yabani türlerin kullanılan, de ve yaban hayatı (insanlar) ekolojik cevap vermek için toksisite model olarak-, davranışsal-ve kuruluşun birden çok biyolojik düzeyde örümceklerle ilgili sorular. Türler Drosophila cins içinde bir model olarak kullanarak, çeşitli ölçülebilir bitiş noktaları vardır olası11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. İn addition, Drosophila modeli kullanarak, toksikolog yapabilirsiniz: 1) etik etkileri kuruluşun; birden çok biyolojik düzeyde bağlantı 2) acil faktörler ve geliştirme rolü dahil; 3) çalışma ekolojik önemli bitiş noktaları (yanı sıra tıbbi olarak önemli bitiş noktası); 4) aynı anda birden fazla stres test; 5) ve test uzun vadeli multigenerational (Örneğin evrimsel ve transgenerational) stresler etkileri. Bu nedenle, Drosophila modeli sistemi olarak kullanmak yaklaşımlar mekanik yaklaşımlar doğuştan D. melanogaster laboratuar suşları ile eğitim için sınırlı değildir, çok sayıda sağlar.
Bu yazıda, biz yetiştirme ve çeşitli toksikolojik soruları cevaplamak için Drosophila toplamak için yöntemler mevcut. Daha ayrıntılı olarak, 1 için metodoloji tarif) ile bir veya daha fazla kirletici; bağcıklı orta Drosophila yetiştirme 2) toplama Drosophila geliştirme (üçüncü-biçim larva, pupa örnekleri, yeni eclosed yetişkin ve olgun yetişkin dolaşıpÖrneğin ); ve 3) test Kuşaklararası ve transgenerational iletim yanı sıra uzun vadeli yaydıkları maruz kalma evrimsel etkileri kirli ortamda Drosophila yetiştirme. Bu iletişim kuralı, önceki yazarlar18,19,20,21,22,23,24kullanarak,25 bildirdin farklı, genetik, fizyolojik ve davranışsal etkileri gelişimsel kurşun (Pb2 +) maruz kalma. Bu protokolü nasıl kirleticiler için insanlar ve yaban hayatı hiç giderek kirli ortamda risk faktörleri vardır anlamak için gerekli daha bütünsel bir toksikolojik yaklaşımı kullanmaya toksikolog sağlar.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Onlar nadiren toksikolojik çalışmalarda kabul edilir rağmen acil özellikleri ve dış faktörler (nüfus ve ekosistem düzeyi etkileşimleri, özellikle) ekolojik önemli bitiş noktaları, arabuluculuk içinde önemli rol oynarlar. D. melanogaster birkaç isim toxicants, davranış, nörolojik ve genetik etkileri için toksikoloji modeli olarak ortaya çıkıyor. Daha da önemlisi, Drosophila cins içinde tür acil özellikleri dahil ve toksikoloji araştırma ekolojik ilgili soruları cevaplamak bir bütünleştirici çerçeve yaklaşım için bir model sistem olarak yararlı olabilir. Bu kağıt amacı fenotipik çıkışlarını ve ekolojik ilgili sorular bir dizi için bir model sistem olarak kullanılacak kirleticiler için Drosophila cins içinde tür maruz kalmaları için bir protokol sağlamaktır. Daha ayrıntılı olarak, bu protokolü 1 olarak kullanılabilir) organizasyon çok biyolojik düzeyde bağlantı ve toxicants her iki birey ve nüfus düzeyi fitness üzerinde; etkisini anlamak 2) toxicants etkisini gelişimsel pozlama farklı aşamalarında test; 3) test sonuçları kirleticilerin multigenerational ve evrimsel; ve 4) aynı anda birden fazla kirletici ve stres test.

Sözlü olarak Drosophila contaminant(s) boyunca geliştirme için teşhir ederek çeşitli toksikolojik sorular Drosophila biyolojik organizasyonun farklı düzeylerde açarak test edilebilir. Bu bölümde daha önce yayımlanmış belgeleri23,24saat içinde bu iletişim kuralını kullanan elde temsilcisi sonuçları sunar. Özellikle, bu iletişim kuralı daha önce birikimi, ortadan kaldırılması ve kurşun...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory at JoVE.com

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Bu yazıda, fenotipik olarak çıkışları farklı gelişim aşamalarında bir dizi pozlama etkisini Eğitim amacı ile kirleticiler için Drosophila cins içinde tür teşhir için ve daha fazla bir nesil için detaylı bir protokol sağlar.

Drosophila toksisite laboratuvarda test etmek için bir omurgasız Model sistemi olarak kullanmak için deneysel protokol

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K Görüntüleme.  Colorado State University-Pueblo. Bu yazıda, fenotipik olarak çıkışları farklı gelişim aşamalarında bir dizi pozlama etkisini Eğitim amacı ile kirleticiler için Drosophila cins içinde tür teşhir için ve daha fazla bir nesil için detaylı bir protokol sağlar.

Video: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Nörobilim

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Gelişim Biyolojisi

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Yetişkin için tat Tercihi Testi<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

Hücre Kültüründe ve Drosophila melanogaster'de Çinko Oksit Nano partiküllerinin Toksisite Çalışması

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Tıp

Topical Application Bioassay to Quantify Insecticide Toxicity for Mosquitoes and Fruit Flies

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. Insecticide resistance surveillance of mosquito populations is typically done through Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bottle bioassays or World Health Organization (WHO) tube tests. However, these methods can result in a high degree of variability in mortality data due to variable insecticide contact with&#160;the insect, the relatively small numbers of organisms tested, extensive variation in mass between populations, and constantly changing environmental conditions, leading to variable outcomes. This paper presents the topical application bioassay, adapted as a high-throughput phenotypic bioassay for both mosquitoes and fruit flies, to test large numbers of insects along&#160;a range of insecticide concentrations.
This assay 1) ensures consistent treatment and insecticide contact with every organism, 2) produces highly specific dose-response curves that account for differences in average mass between strains and sexes (which is particularly important for field-collected organisms), and 3) allows for the calculation of statistically rigorous median lethal doses (LD50), which are necessary for resistance ratio comparisons-an alternative surveillance approach from diagnostic dose mortality, which is also used for larvicide resistance surveillance. This assay will be a complementary tool for accurately phenotyping mosquito populations and, as illustrated using fruit flies, is easily adaptable for use with other insects. We argue that this assay will help fill the gap between genotypic and phenotypic insecticide resistance in multiple insect species.

We describe the methodology and importance of the topical application bioassay to measure insecticide susceptibility in mosquitoes and fruit flies. The presented assay is high-throughput, utilizes insect mass-thus allowing for calculating a mass-relativized lethal dose instead of concentration-and likely has lower variability than other similar methods.

Sivrisinekler ve Meyve Sinekleri için İnsektisit Toksisitesini Ölçmek için Topikal Uygulama Biyotahlili

The continued use of insecticides for public health and agriculture has led to widespread insecticide resistance and hampering of control methods. ...

Biyoloji

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Erişkin Drosophila Melanogaster'de Kimyasal Toksisitenin Değerlendirilmesi

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Lifespan Protocol for Drosophila melanogaster: Generating Survival Curves to Identify Differences in Fly Longevity

Source: Bovier, T. F., et al. <a href="https://www.jove.com/video/59535/" target="_blank">Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan protocol to measure how different experimental conditions affect flies&#39; longevity and generate survival curves in the process to quantify the experimental outcomes. The sample protocol features the assay being applied to study the effects on longevity from exposure to varying concentrations of endocrine disruptor chemicals, or EDCs, such as 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2).

Drosophila melanogaster için Yaşam Süresi Protokolü: Sinek Uzun Ömürlülüğündeki Farklılıkları Belirlemek için Hayatta Kalma Eğrileri Oluşturma

Source: Bovier, T. F., et al. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
Scientists use the Drosophila lifespan ...