Esta publicação foi apoiada por uma concessão do Ministério da educação (PR prêmio #P031C160025-17, o título do projecto: 84,031 C) para as comunidades de Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) para construir tronco ativo engajamento (C-BASE). Agradecemos a atual zoologia e Elsevier para fornecer os direitos para usar os resultados representativos publicado em papéis anteriores, bem como os editores de JoVE por nos oferecer a oportunidade de publicar este protocolo. Gostaríamos também de agradecer o programa C-BASE, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE e departamento de biologia, CSU-Pueblo), departamento de biologia da CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (departamento de biologia, Skidmore College) e Dr. Claire Varian Ramos (Departamento de biologia, Universidade do estado do Colorado-Pueblo) pelo apoio e assistência.

O seguinte é um protocolo experimental usado para trás espécies do gênero Drosophila no meio contaminado quando a ingestão oral de uma toxina é apropriada; outras formas de exposição são possíveis usando a drosófila modelo11,15,16,26. Os métodos descritos neste protocolo têm sido descritos anteriormente por Hirsch et al . 19 e Peterson et al . 23 , 24 , 25.
1. configurar ações populações de Drosophila em laboratório de pesquisa
<ol><li>Configurar uma incubadora do ambiente controlado (ou pequena sala) para as populações de estoque de casa de Drosophila , definindo as incubadoras para uma temperatura constante, ciclo de luz: escuro e umidade, dependendo das preferências das espécies teste. Nota: Condições ambientais preferenciais variará consoante a ecologia nativa da espécie escolhida para o estudo. Por exemplo, d. melanogaster é nativo de África subsahariana27 e é normalmente mantida em 25 ° C, ciclo de luz: escuro 12:12 e aproximadamente 60% umidade16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. por outro lado, d. montana gama estende-se durante a maior parte do Canadá e E.U.A. centro-oeste, uma região muito mais fria; Portanto, d. montana é normalmente mantida em 19 – 20 ° C e, por vezes, um regime de 24 h de luz para simular condições durante a temporada de acasalamento31. Para uma descrição mais detalhada das escalas geográficas de diversas espécies de Drosophila, consulte os padrões de especiação de Drosophila site32.</li>
	<li>
Obter uma espécie de drosófila preferida e/ou linha pura ou um centro de estoque (ver tabela de materiais), outro laboratório de pesquisa em cima do pedido, ou coletar selvagens, populações geneticamente variáveis do campo. Nota: As etapas a seguir explicam os métodos para coletar as populações selvagens, geneticamente variáveis de drosófila para manter no laboratório de pesquisa. Esses métodos foram modificados de Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 para recolher a maior diversidade de espécies de uma só vez, ao invés de espécies-alvo específico com uma fonte de isca.<ol>
<li>Congelar a meia dúzia dezenas bananas maduras no congelador durante a noite e descongelar antes de definir a isca de armadilhas.</li>
		<li>Prepare vários L 1 – 2 garrafas plásticas cortando uma fenda em forma de u na parte da frente da garrafa para permitir moscas ser capturado na isca de garrafa e não escape. Cap as garrafas de plástico com suas tampas de garrafa, para que as moscas não escapar através de tampas.</li>
		<li>Adicione a banana descongelada para o fundo das garrafas para que o fundo das garrafas contém aproximadamente uma polegada de banana. Coloque uma fatia de tomate maduro na garrafa. Adicione uma pasta de levedura (fermento sobra do procedimento de fabricação de cerveja) para a banana no fundo da garrafa para que a banana fica de molho no chorume fermento.</li>
		<li>Varas de madeira (na posição vertical vertical) adicione ao frasco para que as moscas têm um substrato limpo a pisar longe do chorume de fermento e banana. A Figura 1 ilustra o produto final desses métodos.</li>
		<li>Pendurar a isca garrafas em árvores durante a noite e verificar que cada aspiração de boca de 24 h. voa de garrafas e coloque individualmente fêmeas em frascos com meio para criar linhas de iso-fêmea. Nota: Multi femininas linhas podem ser criadas, no entanto, somente se as fêmeas de cada espécie podem ser claramente identificadas. Além disso, moscas do gênero Drosophila ocupam diferentes nichos ecológicos e terão diferentes necessidades dietéticas dependendo desses nichos (Werner e Jaenike34); Ver Werner e Jaenike34 para recomendações de dieta e receitas de comida.</li>
		<li>Examine a prole de1 F adulta sob o microscópio de dissecação para identificar a espécie do coletados drosófila (ver Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 para assistência na identificação de várias espécies ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Figura 1 : Representação pictórica de armadilhas e isco usado para coletar as populações selvagens de Drosophila no domínio. (A) mosca armadilhas conjunto em um local do campo local no Colorado. (B) uma visão mais próxima da mosca armadilhas conjunto neste site de campo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="3"><li>Manter a iso-fêmea ou as linhas multi femininas em uma incubadora do ambiente controlado ou quarto com temperatura constante, ciclo de luz: escuro e umidade. Para fazer isso, casa voa em frascos ou garrafas no preferido médio e permitir que as fêmeas gravid para pôr ovos no meio. Monitore os frascos para a presença de larvas e pupas. Nota: Moscas do gênero Drosophila ocupam nichos ecológicos diferentes e terão diferentes necessidades dietéticas e ambientais abióticas preferências dependendo desses nichos33,34. Preferências ambientais e recomendações dietéticas (e novas instruções sobre criação de voar) podem ser encontrados em Elgin e Miller28, Shaffer et al. 29, stocker e Gallant30, Markow e o ' Grady33e Werner e Jaenike34. Se usando espécies selvagens capturados, condições ambientais locais podem ser simuladas nas incubadoras até que as espécies podem ser identificadas.</li>
	<li>Transferir ações frequentemente para meio fresco, descartando antigos frascos, para manter as linhas saudáveis e evitar a infecção de ácaros. Nota: A frequência da transferência dependerá do ciclo de vida das espécies. Por exemplo, transferi Drosophila melanogaster a cada duas semanas para o meio fresco. Para mais informações sobre manutenção de linhas em laboratório, ver Rand et al. 16, Elgin e Miller28, Shaffer et al. 29, stocker e Gallant30, Greenspan35e educação científica36do banco de dados.</li>
</ol>2. traseira drosófila no meio contaminado
Nota: Se testando drosófila em laboratório pela primeira vez ou com uma nova contaminant(s), identificar a dose letal (ver Castaneda et al 37 e Massie et al 38 para métodos) e a DL50 (ver Castaneda et al. 37 e Akins et al. 39 para métodos) primeiro. Em seguida, executar uma curva de dose-resposta para identificar concentrações biologicamente relevantes para a saída fenotípica desejada; Ver Hirsch et al. 19 e Zhou et al. 40 para métodos.
<ol><li>Prepare Soluções conservadas em estoque do meio contaminado nas concentrações desejadas, dependendo da química do contaminante. Nota: por exemplo, para preparar soluções estoque de PbAc: Preparar soluções estoque de meio de acetato de chumbo (PbAc) adicionando contaminante a água destilada (dH20) até meio feito com água de contaminante atinge concentração desejada. Por exemplo, uma solução stock de 1.000 µM PbAc, pode ser preparado pela adição de PbAc para dH20 até atingir 1.000 µM PbAc. Além disso, diluir a solução estoque (por exemplo, os 1.000 µM PbAc solução) para a concentração desejada (tais como 500 µM PbAc) e manter essas soluções como estoque também.</li>
	<li>Prepare o suporte, as orientações do fabricante seguir para servir como meio de controle. Preparar meio adicional, as orientações do fabricante seguintes; no entanto, suplemento contaminante solução preparada para dH20. Nota: por exemplo, se usando um instante médio de Drosophila , adicione aproximadamente uma colher de chá instantâneo médio para um frasco plástico. Adicione aproximadamente 5 – 5.5 mL dH20 ao meio. Espalhe alguns grãos de fermento padeiro ao vivo para preparar meio de controle. Para preparar meio experimental, complementam a solução-mãe (como 500 µM PbAc) para dH20.</li>
	<li>
Transferi reprodutivamente viáveis maduros machos e fêmeas de populações de ações para o controle e o meio experimental. Nota: A pós-eclosão de tempo a maturidade reprodutiva é diferente entre as espécies de Drosophila 41.<ol>
<li>Bata levemente o frasco de estoque moscas para baixo com a mão dominante. Certifique-se de que as moscas se mover automaticamente para o fundo do frasco. Com a outra mão, retire a tampa do frasco enquanto grampeia o frasco e coloque um frasco fresco de controle ou o contaminada médio na parte superior do frasco com as moscas. Manter os frascos juntos e flip-los, batendo suavemente, para que as moscas automaticamente são transferidas para o frasco fresco de controle ou meio contaminado. Enquanto ainda batendo o frasco com as moscas, tampa do frasco.</li>
		<li>Repita com mais ampolas, certificando-se de padronizar o número de moscas em cada frasco. Nota: O número total de adultos transferidos através de simples transferência ou anestesia vai depender do tamanho dos frascos usados para evitar a superlotação.</li>
		<li>Incubar a adultos em uma condição ambiental padrão (ou seja, uma incubadora) e permitir que os adultos acasalar e botar ovos no suporte 24-96 h.</li>
		<li>Depois de 24-96 h, descartar adultos em um necrotério (um frasco enchido com óleo mineral e tampado com um funil apertadas) deixando para trás fertilizado ovos (que mais tarde se tornará os sujeitos experimentais) para amadurecer-se para o teste. Coloca os frascos na incubadora para permitir que os ovos desenvolver.</li>
		<li>Monitore os frascos para larvas de ínstar vagando à procura de larvas que estão emergindo do meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coletar assuntos Experimental em vários estágios do desenvolvimento
Nota: Disciplinas experimentais podem ser coletadas em qualquer fase do desenvolvimento, colocados nos cegos codificados 15 mL tubos cónicos e testado por acumulação. Métodos para testar o acúmulo de contaminantes dependerá o contaminante que está sendo estudado. Por exemplo, acúmulo de PbAc pode ser testado usando espectrometria de massa Inductively-Coupled Plasma (ICP-MS)42. Além disso, disciplinas experimentais podem ser coletadas em qualquer fase do desenvolvimento a ser testado para uma variedade de efeitos fenotípicos de contaminantes. A Figura 2 ilustra o ciclo de vida de Drosophila 43. A Figura 3 ilustra o protocolo experimental para a exposição e os diferentes estádios de desenvolvimento de coleção.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Figura 2 : Visão geral conceitual de ciclo de vida de d. melanogaster (o sistema mais comumente utilizado modelo Drosophila ). Os estágios do ciclo de vida de drosófila são: 1) ovo 2) primeiro ínstar-larva, larva 3) segundo-ínstar, 4) terceiro instar-larva, 5) vagando larva de terceiro ínstar, 6) Lophozosterops pupa, pupa 7) olhos vermelhos, adulto 8) recém-eclosed e 9) adulto. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Figura 3 : Visão geral conceitual dos métodos expor oralmente drosófila para médio contaminado em ambos os parentais (F0) e as gerações subsequentes (F-1 e para a frente). (A) métodos para exposição oral durante o desenvolvimento da geração exposta. (B) métodos para testar a transferência de contaminantes a prole (F1 para a geração desejada). Esta figura foi modificada de Peterson et al . 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>
Coletar larvas vagando-terceiro ínstar
	<ol>
<li>Começa a monitorar os frascos quando ligar luzes na incubadora, como larvas vão surgir do meio e mova para cima no lado do frasco dentro de um h depois luzes ligar na incubadora. Dentro deste h, retire as larvas vagando-terceiro instar os lados do frasco com cuidado, usando uma vara de madeira ou uma pinça. Nota: O número de larvas disponíveis para coleta dependerá do número de ovos postos em "2.3.4".</li>
		<li>Para remover o excesso de meio de larvas, coloque as larvas em um copo pequeno com dH2O. Pour a dH2O fora o copo e coloque as larvas em um limpador de tarefa delicada. Usando um limpador de tarefa delicada, remova cuidadosamente o excesso de dH2O de larvas.</li>
		<li>Manter as populações experimentais na incubadora do ambiente controlado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coletar os adultos recém-eclosed
	<ol>
<li>Frascos de monitor para eclosão, observando a coloração das pupas ao longo dos lados dos frascos. Nota: Pupas vão escurecer durante o desenvolvimento. Tempo de desenvolvimento, particularmente pre-eclosão, depende da espécie testada.</li>
		<li>Quando os primeiros adultos começam a eclose, despejar e descarte destes adultos dentro de um necrotério contendo óleo mineral.</li>
		<li>Quando as luzes se ligar na incubadora na manhã seguinte, despejar e descartar qualquer adultos de idade desconhecida (ou virgindade) que podem ter eclosed durante a noite ou durante as luzes de peça sobre.</li>
		<li>Aproximadamente 4 h depois, anestesiar qualquer adultos surgido como adultos recém-eclosed com uma arma de2 CO em frascos. Coloque adultos num prato de2 CO sob um microscópio de dissecação. Sexo adultos procurando por pentes de sexo sobre os forelimbs de machos e ovipositors nas fêmeas. Nota: D. melanogaster devem ser recolhidos dentro de 6 h de eclosão para evitar o acasalamento, mas outras espécies podem ter mais desenvolvimento vezes (e, portanto, não precisam ser coletados dentro deste prazo).</li>
		<li>Adultos separados na placa CO2 , usando uma vara de madeira. Transfira delicadamente adultos em grupos específicos de sexo usando uma vara de madeira para a média correspondente história pré-existente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coletar os adultos maduros pós eclosão
	<ol>
<li>Permitir que adultos permaneçam no média correspondente pré-eclosão exposição do estágio de ovo para a eclosão de pós idade desejada em uma incubadora do ambiente controlado.</li>
		<li>Transferi individualmente adultos para o meio de controle para 24h antes do teste para permitir que os adultos aparar o excesso de meio contaminado fora de seus corpos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. traseira disciplinas experimentais para testar os efeitos de várias gerações ou exposição transgeracional.
<ol><li>Para a traseira da geração parental (aka o P0 ou gerações de0 F), transferir adultos de populações das ações de controle e o experimental médio seguindo as etapas em "2.1" para "2.3" e "3.1" para "3.3".</li>
	<li>Quando os adultos estão reprodutivamente maduros (ver Pitnick et al. 41), a uma transferência (como indicado em 2.3.1), um frasco de machos para um frasco novo de controle ou meio experimental. Isoladamente, transferi um frasco de fêmeas ao frasco fresco que agora contém os machos. Permitir a adultos para companheiro e colocam ovos no meio de 24-96 h.. despejo e descartar a adultos em um necrotério contendo óleo mineral e re-incubar frascos para permitir que a prole desenvolver.</li>
	<li>Repita as etapas 4.1 através de 4.2 dependendo o número desejado de gerações.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Drosophila melanogaster foi estabelecido como um poderoso modelo para uma variedade de processos biológicos devido a extensa conservação de genes e vias entre d. melanogaster e humanos13,14. Pelas mesmas razões que é um poderoso modelo para a ciência médica, Drosophila tem emergido como um sistema de modelo adequado para estudar o impacto da poluição antropogênica sobre uma série de parâmetros toxicológicos. Vários laborat...

Todos os anos, aproximadamente 1.000 novas substâncias químicas são introduzidas pela indústria química1,2; no entanto, os impactos ambientais de apenas uma pequena percentagem destes produtos químicos são testados antes de distribuição2,3. Apesar de catástrofes em grande escala são incomuns, exposição crônica e subletais de uma grande variedade de poluentes são difundidos em seres humanos e animais selvagens4,5. O foco histórico de Ecotoxicologia e toxicologia ambiental foi testar a letalidade, única exposição química, exposição aguda e os efeitos fisiológicos da exposição, como um meio de medir o impacto de poluentes na sobrevivência6, 7 , 8 , 9 , 10. embora não haja uma mudança no sentido éticas e não-invasiva de abordagens à experimentação animal, as abordagens atuais estão limitando por causa do papel esse desenvolvimento, propriedades emergentes e fatores externos (tais como o nível de população e interações do ecossistema-nível) jogam na mediação ecologicamente importantes pontos de extremidade8. Portanto, há uma necessidade de métodos que incorporem uma abordagem mais holística, sem sacrificar a vida selvagem e/ou vertebrados no laboratório.
Sistemas modelo de invertebrados, como Drosophila melanogaster, são uma alternativa atraente para abordar a necessidade de uma abordagem mais holística para testes de toxicidade. D. melanogaster, foi originalmente desenvolvido como um sistema modelo invertebrados para pesquisas genéticas relacionadas a humanos há um século atrás11. D. melanogaster agora é proeminentemente usada como uma alternativa de modelo de vertebrados por vários motivos: 1) a conservação de genes e vias entre d. melanogaster e humanos; 2) tempo de geração curto em relação aos modelos de vertebrados; 3) barato custo de manutenção; 4) facilidade na geração de tamanhos de amostra grande; e 5) pletora de fenotípica e ecologicamente-relevantes pontos de extremidade disponíveis para testes11,12,13,14,15,16,17 .
Vários laboratórios11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 estão usando d. melanogaster como uma alternativa de vertebrados modelo para testes de toxicidade para compreender os impactos da poluição sobre os seres humanos. Espécies selvagens locais de Drosophila podem ser utilizadas, também, como modelos de toxicidade para a vida selvagem (e humanos) responder ecologicamente-, comportamentalmente-e evolutivamente relevantes perguntas em vários níveis biológicos de organização. Utilizando espécies do género Drosophila como modelo, vários pontos de extremidade mensuráveis são possíveis11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. In addition, usando o modelo de Drosophila , toxicologistas podem: 1) eticamente vincular os efeitos em vários níveis biológicos da organização; 2) incorporar o papel de fatores emergentes e desenvolvimento; 3) estudo ecologicamente importantes pontos de extremidade (além de medicamente importantes pontos de extremidade); 4) testar vários estressores simultaneamente; 5) e teste a longo prazo várias gerações (por exemplo, evolutiva e transgeracional) implicações de estressores. Portanto, usar drosófila como um sistema de modelo permite que uma multiplicidade de abordagens, que não se limitando a estudar abordagens mecanicistas com linhagens puras de d. melanogaster no laboratório.
Neste trabalho, apresentamos os métodos para criação e coletando drosófila para responder a várias questões toxicológicas. Mais especificamente, descrevemos a metodologia para 1) criação de Drosophila em meio misturado com um ou mais poluentes; 2) coletando Drosophila durante todo o desenvolvimento (por exemplo, vagando larvas de terceiro instar, casos pupal, recém-eclosed adultos e adultos); e 3) criação de Drosophila a médio contaminado teste intergeracional e transmissão transgeracional, bem como as implicações evolutivas de exposição tóxica a longo prazo. Usando este protocolo, anterior autores18,19,20,21,22,23,24,25 relataram diferentes efeitos fisiológicos, genéticos e comportamentais do desenvolvimento chumbo (Pb2 +) exposição. Este protocolo permite toxicologistas usar uma abordagem mais holística e toxicológica, que é essencial para a compreensão de como os poluentes são fatores de risco para os seres humanos e animais selvagens em um ambiente cada vez mais poluído.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Propriedades emergentes e fatores externos (população-ecossistema-nível e interações, em particular) desempenham um papel importante na mediação ecologicamente importantes pontos de extremidade, embora raramente são considerados em estudos toxicológicos. D. melanogaster está emergindo como um modelo de toxicologia para os impactos comportamentais, neurológicos e genéticos das substâncias tóxicas, para citar alguns. Mais importante, a espécie do género Drosophila pode ser utilizado como um sistema modelo para uma abordagem integrativa quadro para incorporar propriedades emergentes e responder perguntas ecologicamente relevantes na pesquisa de toxicologia. O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para expor espécies do género Drosophila aos poluentes para ser usado como um sistema modelo para uma gama de saídas fenotípicas e perguntas ecologicamente relevantes. Mais especificamente, este protocolo pode ser usado para 1) link vários níveis biológicos de organização e compreender o impacto de substâncias tóxicas em ambos adequação do nível de indivíduo e população; 2) testar o impacto de substâncias tóxicas em diferentes estágios de desenvolvimento, exposição; 3) implicações de várias gerações e evolutiva teste de poluentes; e 4) testar vários contaminantes e estressores simultaneamente.

Ao expor oralmente drosófila para uma contaminant(s) durante todo o desenvolvimento, várias questões toxicológicas podem ser testados, expondo a drosófila em diferentes níveis de organização biológica. Esta seção apresenta resultados representativos obtidos usando este protocolo em artigos publicados anteriormente23,24. Em particular, este protocolo foi usado anteriormente para avaliar a acumulação, ...

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Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Neste trabalho, nós fornecemos um protocolo detalhado para expor a espécie do género Drosophila aos poluentes com o objetivo de estudar o impacto da exposição sobre uma gama de saídas fenotípicas em diferentes estádios de desenvolvimento e para mais de uma geração.

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.7K visualizações.  Colorado State University-Pueblo. Neste trabalho, nós fornecemos um protocolo detalhado para expor a espécie do género Drosophila aos poluentes com o objetivo de estudar o impacto da exposição sobre uma gama de saídas fenotípicas em diferentes estádios de desenvolvimento e para mais de uma geração.

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Neurociência

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Biologia do Desenvolvimento

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval</

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Ensaio de Preferência gosto para Adulto<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Imunologia e Infecção

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Avaliação da toxicidade química em adultos de Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Resumo

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Análise Funcional do circuito de alimentação das larvas em Drosophila

Uma plataforma "caseira" acessível e eficiente para estudos comportamentais de Drosophila e um protocolo de acompanhamento para respirometria mitocondrial larval

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Ensaio de Preferência gosto para Adulto

Estudo de toxicidade de nanopartículas de óxido de zinco em cultura celular e em Drosophila melanogaster

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

Avaliação da toxicidade química em adultos de Drosophila melanogaster