Questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione del Department of Education (premio PR n #P031C160025-17, il titolo del progetto: 84,031 C) alle comunità Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) per costruire staminali attivo impegno (C-BASE). Ringraziamo corrente zoologia ed Elsevier per fornire i diritti per utilizzare i risultati rappresentativi pubblicati in precedenti lavori, come pure la redazione di Giove per averci fornito l'opportunità di pubblicare questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare il programma C-BASE, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE e dipartimento di biologia, CSU-Pueblo), dipartimento di biologia di CSU-Pueblo, Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (dipartimento di biologia, Skidmore College) e Dr. Claire Varian Ramos (Dipartimento di biologia, Pueblo Colorado State University) per il loro sostegno e assistenza.

Il seguente protocollo è un protocollo sperimentale utilizzato per posteriore specie del genere Drosophila su supporto contaminato quando l'ingestione orale di una tossina è appropriata; altre forme di esposizione sono possibili utilizzando la drosofila modello11,15,16,26. I metodi descritti nel presente protocollo precedentemente sono stati descritti da Hirsch et al. 19 e Peterson et al. 23 , 24 , 25.
1. impostare Stock popolazioni di Drosophila nel laboratorio di ricerca
<ol><li>Impostare un incubatore di controllo ambientale (o piccola camera) alle popolazioni stock house di Drosophila impostando le incubatrici per una temperatura costante, ciclo luce: buio e umidità, a seconda delle preferenze della specie in esame. Nota: Comodo condizioni ambientali variano dipendendo il nativo ecologia della specie scelto per lo studio. Ad esempio, d. melanogaster è originaria dell'Africa sub-sahariana Africa27 e in genere viene mantenuta a 25 ° C, 12:12 ciclo di luce: buio e circa 60% umidità16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. d'altra parte, p. montana gamma si estende in gran parte del Canada e negli Stati Uniti midwest, una regione molto più freddo; di conseguenza, p. montana è in genere mantenuta a 19 – 20 ° C e, talvolta, un regime di luce 24h per simulare condizioni durante la stagione degli amori31. Per una descrizione più dettagliata delle gamme geografiche di varie specie di Drosophila, vedere il sito Web modelli di speciazione di Drosophila 32.</li>
	<li>
Ottenere un comodo specie di Drosophila e/o la linea inbred da entrambi un centro stock (Vedi tabella materiali), un altro laboratorio di ricerca su richiesta, o Raccogli selvatici, popolazioni geneticamente variabile dal campo. Nota: La procedura seguente spiega i metodi per raccogliere le popolazioni selvatiche, geneticamente variabile della drosofila per mantenere nel laboratorio di ricerca. Questi metodi sono stati modificati da Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 per raccogliere la massima diversità di specie in una volta, piuttosto che di specie particolare di destinazione con uno fonte di esca.<ol>
<li>Congelare una mezza dozzina banane mature nel freezer durante la notte e scongelare prima di tendere trappole esca.</li>
		<li>Preparare più L 1 – 2 bottiglie di plastica dal taglio di una fessura a forma di u nella parte anteriore la bottiglia per consentire mosche essere catturati nella bottiglia di esca e non fuggire. Tappo delle bottiglie di plastica con il loro tappo di bottiglia quindi le mosche non sfuggono via i coperchi.</li>
		<li>Aggiungere la banana decongelata al fondo delle bottiglie in modo che il fondo delle bottiglie contiene circa un pollice di banana. Mettete una fetta di pomodoro maturo in bottiglia. Aggiungere un impasto di lievito (il lievito rimasto dal processo di fabbricazione di birra) alla banana nella parte inferiore della bottiglia in modo che la banana ottiene in ammollo i residui di lievito.</li>
		<li>Aggiungere bastoni di legno (in posizione verticale verticale) alla bottiglia così le mosche hanno un substrato pulito ad allontanarsi sull'impasto di lievito e banana. La figura 1 illustra il prodotto finale di questi metodi.</li>
		<li>Appendere esca bottiglie in alberi durante la notte e controllare che ogni aspirato di bocca di 24 h. vola fuori bottiglie e posizionare singolarmente le femmine in fiale con il mezzo per creare linee di iso-donna. Nota: Linee multi-femminili possono essere create, tuttavia, solo se le femmine di ogni specie possono essere chiaramente identificate. Inoltre, mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche dipendendo quelle nicchie (Werner e Jaenike34); vedere Werner e Jaenike34 per dieta consigli e ricette di cucina.</li>
		<li>Esaminare i figli adulti di1 F sotto il microscopio di dissezione per identificare la specie dei raccolti della drosofila (Vedi Markow e o ' Grady33 e Werner e Jaenike34 per assistenza nell'identificazione delle varie specie ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Figura 1 : Rappresentazione pittorica di esche e utilizzato per raccogliere le popolazioni selvatiche di Drosophila nel campo. (A) Fly trappole insieme in un sito di campo locale in Colorado. (B) una vista ingrandita del fly trappole insieme a questo sito di campo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="3"><li>Mantenere la iso-femmina o le linee multi-femminile in un incubatore di controllo ambientale o una stanza con temperatura costante, ciclo luce: buio e l'umidità. Per effettuare questa operazione, casa Vola in fiale o flaconi in preferito medio e lasciano le femmine gravide depongono le uova nel mezzo. Monitorare le fiale per la presenza di larve e pupe. Nota: Mosche del genere Drosophila occupano nicchie ecologiche diverse e avranno diverse esigenze dietetiche e ambientali abiotiche preferenze dipendendo quelle nicchie33,34. Preferenze ambientali e raccomandazioni dietetiche (e ulteriori istruzioni su allevamento Vola) possono essere trovati in Elgin e Miller28, Shaffer et al. 29, stocker e Gallant30, Markow e o ' Grady33e Werner e Jaenike34. Se utilizzando specie catturati, le condizioni ambientali locali possono essere simulate in incubatrici fino a quando la specie può essere identificata.</li>
	<li>Trasferire le scorte frequentemente a mezzo fresco, scartando vecchie fiale, per mantenere sani linee ed evitare l'infezione da acari. Nota: La frequenza di trasferimento dipenderà il ciclo di vita della specie. Ad esempio, trasferire Drosophila melanogaster ogni 2 settimane a mezzo fresco. Per ulteriori informazioni sul mantenimento di linee in laboratorio, vedere Rand et al. 16, Elgin e Miller28, Shaffer et al. 36di Database 29, stocker e Gallant30, Greenspan35e scienze della formazione.</li>
</ol>2. posteriore della drosofila nel terreno contaminato
Nota: Se il test della drosofila in laboratorio per la prima volta o con un nuovo contaminant(s), identificare la dose letale (Vedi Castaneda et al. 37 e Massie et al. 38 per i metodi) e la DL50 (vedere Castaneda et al. 37 e Akins et al. 39 per metodi) prima. Quindi, eseguire una curva dose-risposta per identificare concentrazioni biologicamente rilevanti per l'output desiderato fenotipica; vedere Hirsch et al. 19 e Zhou et al. 40 per i metodi.
<ol><li>Preparare soluzioni di riserva del mezzo contaminato presso la concentrazione desiderata, dipendendo la chimica del contaminante. Nota: ad esempio, per preparare soluzioni di riserva di PbAc: preparare soluzioni di riserva di acetato di piombo (PbAc) medio aggiungendo contaminante di acqua distillata (dH20) fino al medio realizzato con contaminanti dell'acqua raggiunge la concentrazione desiderata. Ad esempio, una soluzione stock di 1.000 µM PbAc, può essere preparata aggiungendo PbAc al dH20 fino a 1.000 µM PbAc. Diluire la soluzione stock (ad es. il 1.000 µM PbAc soluzione) fino alla concentrazione desiderata (ad esempio 500 µM PbAc) e mantenere queste soluzioni come magazzino pure.</li>
	<li>Preparare il supporto, le linee guida del produttore riportato per servire come mezzo di controllo. Preparare ulteriore supporto, le linee guida del produttore riportato; Tuttavia, supplemento contaminante soluzione preparata per dH20. Nota: ad esempio, se si utilizza un istante media della drosofila , aggiungere circa un cucchiaino da tè istantaneo medio ad un flacone di plastica. Aggiungere circa 5 – 5.5 mL dH20 al mezzo. Cospargere alcuni grani di lievito vivo per preparare il supporto di controllo. Per preparare il supporto sperimentale, integrare la soluzione di riserva (ad esempio 500 µM PbAc) per dH20.</li>
	<li>
Trasferire riproduttivo praticabile maturi maschi e femmine da popolazioni stock nel controllo e il supporto sperimentale. Nota: Il post-eclosion tempo per la maturità riproduttiva è diversa tra le specie di Drosophila 41.<ol>
<li>Picchiettare delicatamente il flaconcino di mosche stock giù con la mano dominante. Garantire che le mosche si sposta automaticamente sul fondo del flaconcino. Con l'altra mano, togliere il tappo del flaconcino mentre toccando il flaconcino e collocare un fresco flacone di controllo o contaminato medio sopra la fiala con le mosche. Tenere le fiale insieme e capovolgerli sopra, picchiettando delicatamente, in modo che le mosche sono trasferite automaticamente al flaconcino fresco di controllo o contaminato medio. Mentre ancora toccando il flaconcino con le mosche, tappo del flaconcino.</li>
		<li>Ripetere con più fiale, assicurandosi di standardizzare il numero di mosche in ogni flaconcino. Nota: Il numero totale di adulti trasferiti tramite trasferimento singolo o anestesia dipenderà la dimensione delle fiale utilizzate per evitare il sovraffollamento.</li>
		<li>Incubare gli adulti in condizioni ambientali standard (cioè un'incubatrice) e consentono agli adulti di accoppiarsi e deporre le uova nel mezzo per 24 – 96 h.</li>
		<li>Dopo 24 – 96 h, scartare gli adulti in un obitorio (un pallone riempito con olio minerale e tappate con un imbuto attillati) lasciando dietro di sé fecondato uova (che diventano in seguito i soggetti dell'esperimento) di maturare per il test. Posizionare le fiale nell'incubatrice per consentire le uova a sviluppare.</li>
		<li>Monitorare le fiale per larve instar vagando alla ricerca di larve che stanno emergendo dal mezzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccogliere soggetti sperimentali nelle varie fasi dello sviluppo
Nota: I soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase dello sviluppo, nel cieche codificate provette coniche da 15 mL e testato per accumulo. Metodi per testare l'accumulo di contaminanti dipenderà il contaminante in fase di studio. Ad esempio, accumulo di PbAc possa essere testato utilizzando la spettrometria di massa di Inductively-Coupled al Plasma (ICP-MS)42. Inoltre, i soggetti sperimentali possono essere raccolti in qualsiasi fase inerente allo sviluppo per essere testati per una varietà di effetti fenotipici di contaminanti. La figura 2 illustra il ciclo di vita di Drosophila 43. La figura 3 illustra il protocollo sperimentale per l'esposizione e le varie fasi di sviluppo per la raccolta.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Figura 2 : Panoramica sui concettuale di ciclo di vita di d. melanogaster (il sistema più comunemente usato di modello drosofila ). Le fasi del ciclo di vita di Drosophila sono: 1) uovo, larva 2) primo-instar, 3) seconda-instar larva, 4) terza-instar larva, 5) vagando terza-instar larva, pupa 6) occhialino, pupa 7) l'effetto occhi rossi, 8) appena obtecta adulto e adulto 9) maturo. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Figura 3 : Panoramica concettuale dei metodi per esporre oralmente Drosophila a medie contaminate parentale (F0) sia le generazioni successive (F1 e successivi). (A) metodi per esposizione orale durante lo sviluppo della generazione esposta. (B) metodi per testare il trasferimento di contaminanti alla prole (F.1 per la generazione desiderata). Questa figura è stata modificata da Peterson et al. 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>
Raccogliere larve instar terzo errante
	<ol>
<li>Avviare il monitoraggio fiale quando luci accendono nell'incubatrice, come le larve si emergono dal mezzo e spostare verso l'alto sul lato del flacone all'interno di un h dopo le luci si accendono nell'incubatrice. All'interno di questo h, rimuovere le larve di terza vagando instar dai lati del flaconcino con cura utilizzando un bastone di legno o delle pinzette. Nota: Il numero di larve disponibile per raccolta dipenderà il numero di uova deposte in "2.3.4".</li>
		<li>Per rimuovere il mezzo in eccesso dalle larve, posto le larve in un piccolo becher con dH2O. Pour la dH2O fuori il becher e posto le larve su un tergicristallo delicato compito. Utilizzando un pulitore delicato compito, rimuovere delicatamente l'eccesso di dH2O dalle larve.</li>
		<li>Mantenere popolazioni sperimentali in un'incubatrice di controllo ambientale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere gli adulti recentemente-obtecta
	<ol>
<li>Fiale di monitor per eclosion osservando la colorazione delle pupe lungo i lati delle fiale. Nota: Pupe scurirà durante lo sviluppo. Tempo inerente allo sviluppo, in particolare pre-eclosion, dipende dalla specie testate.</li>
		<li>Quando i primi adulti iniziano a eclose, dump e scartare questi adulti in una camera mortuaria contenente olio minerale.</li>
		<li>Quando le luci si accendono nell'incubatrice la mattina seguente, dump e scartare qualsiasi adulti di età sconosciuta (o verginità) che possono avere obtecta durante la notte o durante le luci morningbefore su.</li>
		<li>Circa 4 ore più tardi, anestetizzare qualsiasi adulti che è emerso come nuova-obtecta adulti con una pistola di CO2 nei flaconcini. Adulti posto su un piatto di2 CO sotto un microscopio di dissezione. Adulti sesso cercando sesso pettini sulle zampe anteriori dei maschi e ovipositors nelle femmine. Nota: D. melanogaster devono essere raccolte entro 6 h di sfarfallamento per evitare accoppiamento ma altre specie può avere tempi più lunghi dello sviluppo (e di conseguenza, non è necessario essere raccolte entro questo lasso di tempo).</li>
		<li>Separare gli adulti sulla CO2 piastra utilizzando un bastone di legno. Trasferire delicatamente adulti in gruppi di sesso-specifici utilizzando un bastone di legno per la storia pre-esistente corrispondente media.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccogliere gli adulti maturi Eclosion post-della
	<ol>
<li>Consentire a rimanere sull'esposizione media corrispondente pre-eclosion dalla fase di uovo al post-eclosion età desiderata in un'incubatrice di controllo ambientale.</li>
		<li>Trasferire singolarmente gli adulti per il mezzo di controllo per 24 h prima del test per consentire gli adulti per lo sposo di eccesso di terreno contaminato i loro corpi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. posteriore soggetti sperimentali per testare gli effetti di Multigenerational o esposizione transgenerazionale.
<ol><li>Per il posteriore la generazione parentale (aka il P0 o F0 generazioni), transfer adulti da stock popolazioni di controllo e il supporto sperimentale secondo la procedura descritta in "2.1" a "2.3" e "3.1" a "3.3".</li>
	<li>Quando gli adulti sono riproduttivo maturi (vedere Pitnick et al. 41), singolarmente un flaconcino di trasferimento (come indicato in 2.3.1) dei maschi ad un fresco flacone di controllo o medio sperimentale. Trasferire singolarmente un flaconcino di femmine al fresco flacone che ora contiene i maschi. Consentono agli adulti di mate e deporre le uova nel mezzo per 24-96 h. Dump e scartare gli adulti in un obitorio contenenti olio minerale e ri-Incubare fiale per consentire la prole a sviluppare.</li>
	<li>Ripetere i punti 4.1 e 4.2 a seconda il numero desiderato di generazioni.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Drosophila melanogaster è stato stabilito come un potente modello per una gamma di processi biologici a causa la conservazione ricca di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani13,14. Per le stesse ragioni che è un potente modello di scienza medica, Drosophila è emerso come un sistema di modello adatto per studiare l'impatto dell'inquinamento di origine antropica su una gamma di endpoint tossicologici. Diversi laboratori...

Ogni anno, circa 1.000 nuovi prodotti chimici vengono introdotti dalla industria chimica1,2; Tuttavia, l'impatto ambientale di solo una piccola percentuale di questi prodotti chimici è testato prima della distribuzione2,3. Anche se catastrofi su larga scala sono rare, esposizione subletale e cronica per una grande varietà di sostanze inquinanti sono diffuse in entrambi esseri umani e animali selvatici4,5. Al centro storico di ecotossicologia e tossicologia ambientale era quello di testare la letalità, singola esposizione chimica, l'esposizione acuta e gli effetti fisiologici dell'esposizione, come un mezzo per misurare l'impatto degli inquinanti sulla sopravvivenza6, 7 , 8 , 9 , 10. anche se c'è uno spostamento verso approcci etici e non invasiva alla sperimentazione animale, approcci attuali stanno limitando a causa del ruolo che lo sviluppo, proprietà emergenti e fattori esterni (ad esempio livello di popolazione e interazioni a livello di ecosistema) giocano nella mediazione ecologicamente importante endpoint8. Di conseguenza, c'è una necessità per i metodi che includono un approccio più olistico senza sacrificare la fauna selvatica e/o vertebrati in laboratorio.
Sistemi di modello invertebrati marini, come Drosophila melanogaster, sono un'alternativa interessante per affrontare la necessità di un approccio più olistico per test di tossicità. D. melanogaster, è stato originariamente sviluppato come un sistema di modello invertebrati marini per la ricerca genetica umani circa un secolo fa11. D. melanogaster prominente è ora utilizzato come alternativa modello vertebrati per diversi motivi: 1) la conservazione di geni e percorsi tra d. melanogaster e gli esseri umani; 2) tempo di generazione breve rispetto ai modelli vertebrati; 3) economico costo di manutenzione; 4) alleviare nella generazione di campioni di grandi dimensioni; e 5) pletora di fenotipica ed ecologicamente-rilevanti endpoint disponibili per il test11,12,13,14,15,16,17 .
Diversi laboratori11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 ora stanno usando d. melanogaster come alternativa modello vertebrati per test di tossicità per comprendere gli effetti dell'inquinamento sugli esseri umani. Specie selvatiche locali di Drosophila può essere utilizzato, anche, come modelli di tossicità per la fauna selvatica (e gli esseri umani) rispondere a ecologicamente-, relativamente al comportamento-ed evolutivamente pertinenti domande a più livelli biologici di organizzazione. Utilizzando specie del genere Drosophila come modello, diversi endpoint misurabili sono possibili11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Inoltre, utilizzando il modello di Drosophila , tossicologi possono: 1) eticamente collegare effetti a più livelli biologici dell'organizzazione; 2) incorporare il ruolo dei fattori emergenti e lo sviluppo; 3) studio endpoint ecologicamente importanti (oltre agli endpoint medicamente importanti); 4) verificare fattori di stress multipli contemporaneamente; 5) e prova a lungo termine multigenerazionale (ad es. evolutiva e transgenerazionale) implicazioni di fattori di stress. Pertanto, utilizzando la Drosophila come sistema modello consente una moltitudine di approcci, non limitato a studiare approcci meccanicistici con ceppi inbred di d. melanogaster nel laboratorio.
In questa carta, presentiamo i metodi di allevamento e raccolta della drosofila per rispondere a varie domande tossicologiche. Più specificamente, descriviamo la metodologia per 1) allevamento Drosophila in mezzo cucita con uno o più inquinanti; 2) raccogliendo Drosophila durante lo sviluppo (ad es. errante terza-instar larve, pupal casi, appena obtecta adulti e adulti maturi); e 3) l'allevamento della drosofila in medio contaminato e prova intergenerazionale e trasmissione transgenerazionale, come pure le implicazioni evolutive esposizione tossico a lungo termine. Utilizzando questo protocollo, il precedente autori18,19,20,21,22,23,24,25 sono segnalati diversi effetti fisiologici, genetici e comportamentali di sviluppo (Pb2 +) esposizione al piombo. Questo protocollo consente tossicologi di utilizzare un approccio più olistico e tossicologico, che è essenziale per comprendere come gli agenti inquinanti sono fattori di rischio per gli esseri umani e animali selvatici in un ambiente sempre più inquinato.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Proprietà emergenti e fattori esterni (interazioni livello di popolazione e a livello di ecosistema, in particolare) svolgono i ruoli importanti nel mediare gli endpoint ecologicamente importanti, anche se raramente sono considerati negli studi tossicologici. D. melanogaster sta emergendo come un modello di tossicologia per gli effetti comportamentali, neurologici e genetici di sostanze tossiche, per citarne alcuni. Ancora più importante, può essere utilizzato specie del genere Drosophila come sistema modello per un approccio integrativo framework incorporare le proprietà emergenti e rispondere a domande ecologicamente rilevanti nella ricerca di tossicologia. Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo per l'esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti da utilizzarsi come sistema modello per una gamma di uscite fenotipiche e domande ecologicamente rilevanti. Più specificamente, questo protocollo può essere usato per 1) collegare più livelli biologici di organizzazione e comprendere l'impatto delle sostanze tossiche su entrambi fitness a livello individuale e della popolazione; 2) verificare l'impatto delle sostanze tossiche nelle diverse fasi di esposizione inerente allo sviluppo; 3) prova implicazioni multigenerazionale ed evolutivi di inquinanti; e 4) test di contaminanti e fattori di stress multipli contemporaneamente.

Di esporre oralmente Drosophila a un contaminant(s) durante lo sviluppo, possono essere testate varie domande tossicologiche esponendo Drosophila a diversi livelli di organizzazione biologica. Questa sezione presenta risultati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo in articoli precedentemente pubblicati23,24. In particolare, questo protocollo è stato utilizzato in precedenza per valutare l'accumulo, e...

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Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In questo articolo, forniamo un protocollo dettagliato per l'esposizione di specie del genere Drosophila agli inquinanti con l'obiettivo di studiare l'impatto dell'esposizione su una gamma di uscite fenotipiche alle varie fasi di sviluppo e per più di una generazione.

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

experimental-protocol-for-using-drosophila-as-an-invertebrate-model

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

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Neuroscienze

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Biologia dello sviluppo

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitoc

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Gusto Preferenza Assay per adulti<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Immunologia e infezioni

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Valutazione della tossicità chimica nella Drosophila melanogaster adulta

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

Una piattaforma "fatta in casa" economica ed efficiente per gli studi comportamentali sulla Drosophila e un protocollo di accompagnamento per la spiriometria mitocondriale larvale

Gusto Preferenza Assay per adulti

Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

Un modello di ferita Drosophila In Vivo per lo studio della neurorigenerazione la periferica e del sistema nervoso centrale

Valutazione della tossicità chimica nella Drosophila melanogaster adulta