Diese Publikation wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Bildungsministerium (PR-Preis #P031C160025-17, Titel des Projekts: 84,031 C) an der Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) Gemeinschaften zu bauen aktiv STEM Engagement (C-BASE). Wir bedanken uns bei aktuellen Zoologie und Elsevier für die Bereitstellung der Nutzungsrechte an die repräsentativen Ergebnisse veröffentlicht in früheren Arbeiten, sowie die Redaktion des Jupiter für bietet uns die Gelegenheit, dieses Protokoll zu veröffentlichen. Wir möchten auch die C-BASE Programm, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE und Institut für Biologie, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo-Biologie-Abteilung, danke Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Institut für Biologie, Skidmore College) und Dr. Claire Varian Ramos (Institut für Biologie, Kolorado Landesuniversität-Pueblo) für ihre Unterstützung und Hilfe.

Das folgende Protokoll ist ein experimentelles Protokoll verwendet, um die Arten der Gattung Drosophila auf kontaminierten Medium hinten, bei oraler Einnahme eines Toxins geeignet ist; andere Formen der Belichtung sind möglich mit Drosophila Modell11,15,16,26. In diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden zuvor von Hirsch Et Al. beschrieben 19 und Peterson Et al. 23 , 24 , 25.
1. richten Sie Lager Populationen von Drosophila im Forschungslabor
<ol><li>Richten Sie eine ökologisch kontrollierten Inkubator (oder kleine Zimmer) Haus Lager Populationen von Drosophila durch Festlegen der Inkubatoren für eine Konstante Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Luftfeuchtigkeit, je nach den Vorlieben der Testspezies. Hinweis: Bevorzugte Umweltbedingungen variieren abhängig von den einheimischen Ökologie der Arten für die Studie ausgewählt. Z. B. D. Melanogaster stammt aus Sub-Sahara Afrika27 und bleibt in der Regel bei 25 ° C, 12:12-Licht: Dunkel-Zyklus und ca. 60 % Luftfeuchtigkeit16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. auf der anderen Seite D. Montana reicht in den meisten Teilen von Kanada und den USA Mittlerer Westen, einer sehr viel kälteren Region; D. Montana wird daher in der Regel auf 19 – 20 ° C und manchmal eine leichte 24 h-Regime zu simulieren, während der fügenden Jahreszeit31gehalten. Für eine detailliertere Beschreibung der geografischen Bereiche von verschiedenen Arten von Drosophilasiehe die Drosophila Speziation Muster Webseite32.</li>
	<li>
Entweder ein Lager-Center eine bevorzugte Drosophila -Arten und/oder Inzuchtlinie einzuholen (siehe Tabelle der Materialien), ein weiteres Forschungslabor auf Anfrage oder sammle Wild, genetisch Variable Populationen aus dem Feld. Hinweis: Die folgenden Schritte erläutern die Methoden um wilde, genetisch Variable Populationen von Drosophila weiterhin im Forschungslabor zu sammeln. Diese Methoden sind von Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 geändert worden, um die größte Artenvielfalt auf einmal anstatt besondere Zielarten mit einem Köder Quelle erfassen.<ol>
<li>Ein halbes Dutzend Reife Bananen in der Tiefkühltruhe über Nacht Einfrieren und Auftauen vor dem Köder fallen.</li>
		<li>Bereiten Sie mehrere 1 – 2 L Kunststoff-Flaschen durch Schneiden einen u-förmigen Schlitz an der Vorderseite der Flasche, fliegt in den Köder Flasche und nicht Flucht erfasst werden können. Cap die Kunststoff-Flaschen mit ihren Kronkorken, damit die fliegen über die Lider nicht entgehen.</li>
		<li>Fügen Sie die aufgetaute Banane auf den Boden der Flaschen, so dass der Boden der Flaschen ungefähr ein Zoll Banane enthält. Legen Sie eine Scheibe Reife Tomate in der Flasche. Fügen Sie einen Hefe-Slurry (den übrig gebliebenen Hefen den Herstellungsprozess Bier) die Banane an der Unterseite der Flasche, so dass die Banane bekommt in der Hefe Brei einweichen.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu, Holzstäbchen (in aufrechter Position vertikale) in die Flasche damit die fliegen ein sauber Substrat von der Hefe Gülle und Banane auf Weg zu gehen. Abbildung 1 zeigt das Endprodukt dieser Methoden.</li>
		<li>Hängen Sie Köder Flaschen in den Bäumen über Nacht und überprüfen Sie, ob alle 24 h. Mund Absaugen aus Flaschen fliegt und individuell Weibchen in Fläschchen mit Mittel-bis Iso-weiblichen Linien zu erstellen. Hinweis: Multi-weibliche Linien, allerdings entstehen nur dann, wenn die Weibchen der einzelnen Arten eindeutig identifiziert werden können. Darüber hinaus fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche diätetische Anforderungen je nach diesen Nischen (Werner und Jaenike34); Siehe Werner und Jaenike34 für Diät-Empfehlungen und Rezepte.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Erwachsenen F1 Nachkommen unter dem Mikroskop Dissektion um die Arten der gesammelten Drosophila zu identifizieren (siehe Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 für Hilfe bei der Identifizierung von verschiedenen Arten ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Abbildung 1 : Bildliche Darstellung von fallen und Köder verwendet, um wilde Populationen von Drosophila im Feld sammeln. (A) Fly fallen auf ein lokales Feld Standort in Colorado. (B) ein näher Blick auf die Fliegen fallen auf dieser Wiese. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="3"><li>Pflegen Sie das Iso-Weibchen oder die Multi-weiblichen Linien in einem ökologisch kontrollierten Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Feuchtigkeit. Um dies zu tun, Haus fliegt in Fläschchen oder Flaschen in Medium bevorzugt und die trächtigen Weibchen zur Eiablage in das Medium zu ermöglichen. Überwachen Sie die Fläschchen auf das Vorhandensein von Larven und Puppen. Hinweis: Fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse und Umwelt abiotischen Vorlieben abhängig von diesen Nischen33,34. Ökologische Präferenzen und Ernährungsempfehlungen (und weitere Anweisungen auf Fliege Tierhaltung) finden Sie in Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30Markow und O'Grady33und Werner und Jaenike34. Wenn Wildfänge Arten verwenden, können lokale Umweltbedingungen in den Inkubatoren simuliert werden, bis die Spezies identifiziert werden können.</li>
	<li>Übertragen Sie Aktien häufig auf frisches Medium, gesunde Linien zu erhalten und vermeiden Infektion durch Milben alten Fläschchen zu verwerfen. Hinweis: Die Häufigkeit der Übertragung hängt von den Lebenszyklus der Art. Übertragen Sie Drosophila Melanogaster werden z. B. alle 2 Wochen auf frisches Medium. Weitere Informationen zur Verwaltung von Linien im Labor, siehe Rand Et Al. 16, Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30, Greenspan35und naturwissenschaftliche Bildung Datenbank36.</li>
</ol>(2) hinten Drosophila kontaminierten Mittel-
Hinweis: Wenn Drosophila im Labor zum ersten Mal oder mit einem neuen Verunreinigung(s) testen, identifizieren die letale Dosis (siehe Castaneda Et Al. 37 und Massie Et al. 38 für Methoden) und die LD50 (siehe Castaneda Et Al. 37 und Akins Et Al. 39 für Methoden) erste. Führen Sie dann eine Dosis-Wirkungs-Kurve, um biologisch relevante Konzentrationen für die gewünschte phänotypischen Ausgabe zu identifizieren; sehen Sie Hirsch Et Al. 19 und Zhou Et Al. 40 für Methoden.
<ol><li>Vorbereiten des kontaminierten Mediums auf die gewünschte konzentrasion(s), abhängig von der Chemie der Verunreinigung auf lagerlösungen. Hinweis: zum Beispiel, um Stammlösungen PbAc vorbereiten: Stammlösungen Bleiacetat (PbAc) Medium indem Verunreinigung zu destilliertem Wasser (dH20) bis Medium gemacht mit Wasser erreicht gewünschte Schadstoffkonzentration vorzubereiten. Zum Beispiel eine Stammlösung von 1.000 µM PbAc, können werden vorbereitet, indem man PbAc, dH20 bis 1.000 µM erreicht PbAc. Stammlösung (z.B. die 1.000 µM PbAc Lösung) weiter, um die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 500 µM PbAc) und pflegen diese Lösungen als Lager als auch.</li>
	<li>Bereiten Sie Medium, folgende Herstellerangaben als das Steuermedium dienen. Zusätzliche Mittel, folgende Herstellerrichtlinien vorzubereiten; jedoch bereit Ergänzung Verunreinigung Lösung für dH20. Hinweis: zum Beispiel, wenn Nu Drosophila Medium verwenden, fügen Sie etwa einen Teelöffel instant Medium zu einem Kunststoff-Fläschchen hinzu. Das Medium ca. 5 – 5,5 mL dH20 hinzufügen. Streuen Sie ein paar Körner live Bäckerhefe Steuermedium vorzubereiten. Zur Vorbereitung der experimentellen Mittel ergänzen die Stammlösung (z. B. 500 µM PbAc) für dH20.</li>
	<li>
Übertragen Sie reproduktiv lebensfähigen Reife Männchen und Weibchen aus Lager Populationen in der Kontrolle und dem experimentellen Medium. Hinweis: Die Zeit nach dem bewegungsapparate, Geschlechtsreife unterscheidet zwischen der Drosophila -Arten-41.<ol>
<li>Klopfen Sie leicht das Fläschchen Lager fliegen nach unten mit der dominanten Hand. Stellen Sie sicher, dass die fliegen automatisch an das Ende des Röhrchens verschieben. Entfernen Sie mit der anderen Hand die Kappe des Fläschchens beim Tippen auf das Fläschchen und legen Sie ein frisches Fläschchen oder verunreinigte Medium auf das Fläschchen mit den fliegen. Halten Sie die Fläschchen zusammen und drehen Sie sie um, leichtes Klopfen, so dass die fliegen automatisch auf das frische Fläschchen oder verunreinigte Medium übertragen werden. Während noch Antippen der Durchstechflasche mit dem fliegen, Kappe das Fläschchen.</li>
		<li>Wiederholen Sie mit mehr Fläschchen, und achten Sie auf die Anzahl der fliegen in jedes Fläschchen zu standardisieren. Hinweis: Die Gesamtzahl der Erwachsenen übertragen über einzelne Übertragung oder Anästhesie hängt die Größe der Ampullen verwendet, um eine Überfüllung zu vermeiden.</li>
		<li>Brüten Sie Erwachsene in einem standard ökologischen Zustand (d. h. ein Inkubator) und ermöglichen Sie die Erwachsenen, paaren sich und legen ihre Eier in das Medium für 24 / 96 h.</li>
		<li>Nach 24 – 96 h, verwerfen Erwachsene in einem Leichenschauhaus (eine Flasche gefüllt mit Mineralöl und begrenzt mit einem eng anliegenden Trichter) hinterließ befruchtete Eier (die später die Versuchspersonen werden) zu Testzwecken Reifen. Legen Sie die Fläschchen in den Inkubator ermöglicht die Eier zu entwickeln.</li>
		<li>Überwachen Sie die Fläschchen für wandernde Instar Larven durch auf der Suche nach Larven, die aus dem Medium zu entwickeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sammeln von Versuchspersonen in verschiedenen Entwicklungsstadien
Hinweis: Versuchspersonen können in jedem Entwicklungsstadium, platziert in den blinden codierten 15 mL konische Röhrchen und getestet für die Akkumulation gesammelt werden. Methoden zur Prüfung der Ansammlung von Verunreinigungen hängt von der Verunreinigung untersucht. Zum Beispiel kann Ansammlung von PbAc mit Inductively-Coupled Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS)42getestet werden. Darüber hinaus können die Versuchspersonen in jeder Entwicklungsphase für eine Vielzahl von phänotypischen Effekten von Verunreinigungen getestet werden gesammelt werden. Abbildung 2 veranschaulicht die Drosophila -Life-Cycle-43. Abbildung 3 illustriert das experimentelle Protokoll für die Belichtung und die verschiedenen Entwicklungsstadien für Sammlung.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Abbildung 2 : Konzeptionelle Übersicht über den gesamten Lebenszyklus von D. Melanogaster (das am häufigsten verwendete Drosophila Modellsystem). Die Phasen des Lebenszyklus von Drosophila sind: (1) Ei, Larve (2) erste Instar, 3) zweiten Instar Larve, (4) dritte Instar Larve, 5) dritte Instar Larve, Wandern (6) White-eye Puppe, 7) rote-Augen-Puppe, 8) neu-geschlüpften Erwachsenen und 9) älterer Erwachsener. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Abbildung 3 : Grundlegende Übersicht der Methoden zur Aufdeckung von Drosophila Oral kontaminierten Medium in der elterlichen (F-0) und die nachfolgenden Generationen (F1 und höher). (A) Methoden für die orale Exposition während der Entwicklung in der exponierten Generation. (B) Methoden der Übertragung von Kontaminanten an Nachkommen (F1 bis die gewünschte Generation) zu testen. Diese Zahl wurde von Peterson Et Al. modifiziert 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>
Wandern-dritte Instar Larven sammeln
	<ol>
<li>Starten Sie die Überwachung Fläschchen, wenn Lichter in den Inkubator einschalten Larven werden vom Medium entstehen und bewegen sich nach oben auf der Seite das Fläschchen in ein h nach Schalten Sie Lichter im Inkubator. Innerhalb dieser h entfernen Sie Bummel durch Dritte Instar Larven von den Seiten des Fläschchens sorgfältig mit einem Holzstab oder einer Pinzette Hinweis: Die Anzahl der Larven abholbereit hängt von der Anzahl der Eier in "2.3.4".</li>
		<li>Um überschüssige Mittel aus den Larven zu entfernen, legen Sie die Larven in einen kleinen Becher mit dH2O. Pour dH2O aus dem Becher und die Larven auf eine heikle Aufgabe Wischer. Entfernen Sie mit einer heiklen Aufgabe Wischer, vorsichtig die überschüssige dH2O aus die Larven.</li>
		<li>Pflegen Sie experimentellen Populationen im Brutkasten ökologisch kontrolliert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln Sie neu geschlüpften Erwachsene
	<ol>
<li>Monitor-Fläschchen für bewegungsapparate anhand der Färbung der Puppen entlang der Seiten des Vials. Hinweis: Während der Entwicklung werden Puppen dunkler. Entwicklungszeit, besonders vor bewegungsapparate hängt von der Spezies getestet.</li>
		<li>Wenn die ersten Erwachsenen zu Eclose beginnen, dump und entsorgen Sie diese Erwachsenen in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl.</li>
		<li>Wenn die Lichter in den Inkubator am nächsten Morgen einschalten, dump und verwerfen alle Erwachsenen unbekannt Alter (oder Jungfräulichkeit), die geschlüpften über Nacht oder während der Morningbefore Lichter haben können, auf.</li>
		<li>Ca. 4 h später, alle Erwachsenen, die sich als neu geschlüpften Erwachsene mit einer CO2 Pistole in das Fläschchen zu betäuben. Legen Sie Erwachsene auf einen CO2 Teller unter dem Mikroskop Dissektion. Sex Erwachsene durch auf der Suche nach Sex Kämme auf die Vorderbeine der Männchen und Renderbild bei Frauen. Hinweis: D. Melanogaster muss innerhalb von 6 h des bewegungsapparate Paarung vermeiden gesammelt werden aber andere Arten können mehr Entwicklungs-Zeiten haben (und daher auch nicht innerhalb dieses Zeitrahmens gesammelt werden müssen).</li>
		<li>Separate Erwachsene auf dem CO2 Teller mit einem Holzstab. Erwachsene in geschlechtsspezifische Gruppen mit einem Holzstab auf die mittlere passenden vorbestehenden Geschichte sanft zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Post-bewegungsapparate Reife Erwachsene zu sammeln
	<ol>
<li>Können Sie Erwachsene auf die mittlere passenden Pre bewegungsapparate Exposition gegenüber Eistadium auf das gewünschte Alter Post-bewegungsapparate im Brutkasten ökologisch kontrolliert bleiben.</li>
		<li>Übertragen Sie Erwachsene auf das Steuermedium für 24 h vor der Prüfung damit Erwachsene, überschüssige kontaminierten Medium ihre Körper pflegen können einzeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) hinten Versuchspersonen, die Auswirkungen der Mehrgenerationen oder transgenerationalen Belichtung zu testen.
<ol><li>Um die elterliche Generation (aka P0 oder F0 Generationen) hinten, übertragen Sie Erwachsene aus Lager Populationen zu kontrollieren und das experimentelle Medium nach den Schritten in "2.1" auf "2.3" und "3.1" auf "3.3".</li>
	<li>Wenn die Erwachsenen reproduktiv reif sind (siehe Pitnick Et Al. 41), einzeln Transfer (lt. 2.3.1) ein Fläschchen von Männern zu einem frischen Fläschchen der Kontrolle oder experimentelle Medium. Übertragen Sie eine Durchstechflasche Weibchen auf frisches Fläschchen, das Männchen jetzt enthält einzeln. Ermöglichen Sie Erwachsenen, Paaren und Eier legen in das Medium für 24-96 h Dump und verwerfen Sie Erwachsene in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl zu und neu inkubieren Sie Fläschchen um Nachwuchs zu ermöglichen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.2 abhängig von der gewünschten Anzahl der Generationen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Drosophila Melanogaster wurde als ein leistungsfähiges Modell für eine Reihe von biologischen Prozessen aufgrund der umfangreichen Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen13,14gegründet. Aus den gleichen Gründen ist es ein leistungsfähiges Modell für die medizinische Wissenschaft hat Drosophila als geeignete Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen der anthropogenen Umweltverschmutzung auf eine Reihe...

Jedes Jahr werden rund 1.000 neue Chemikalien durch die chemische Industrie1,2eingeführt; Allerdings werden die Umweltauswirkungen der nur ein kleiner Prozentsatz dieser Chemikalien vor Verteilung2,3getestet. Obwohl große Katastrophen ungewöhnlich sind, subletale und chronische Exposition gegenüber einer Vielzahl von Schadstoffen sind weit verbreitet bei Menschen und Tieren4,5. Im historischen Mittelpunkt der Ökotoxikologie und Umwelttoxikologie war testen Letalität, einzelne Exposition gegenüber chemischen Stoffen, akute Exposition und die physiologischen Wirkungen der Exposition, als ein Mittel zur Messung der Auswirkungen von Schadstoffen auf Überleben6, 7 , 8 , 9 , 10. zwar eine Verschiebung hin zu ethischen und nicht-invasive Methoden zu Tierversuchen, aktuelle Ansätze sind begrenzt wegen der Rolle, dass Entwicklung, emergente Eigenschaften und externen Faktoren (z. B. Bevölkerung-Ebene und ökosystemebene Wechselwirkungen) spielen bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte8. Daher gibt es einen Bedarf an Methoden, die einen ganzheitlichen Ansatz zu integrieren, ohne Einbußen bei der Tier-und Pflanzenwelt und/oder Wirbeltiere im Labor.
Wirbellosen Modellsysteme wie Drosophila Melanogaster, sind eine attraktive Alternative zu der Notwendigkeit einen ganzheitlicheren Ansatz zu Toxizitätstests befassen. D. Melanogaster, wurde ursprünglich als ein Wirbellosen Modellsystem für menschliche genetische Forschungen vor etwa einem Jahrhundert entwickelt11. D. Melanogaster prominent dient heute als ein Wirbeltier modellalternative aus mehreren Gründen: 1) die Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen; (2) kurze Generationszeit im Vergleich zu fest gefügten Modellen; (3) günstige Kosten für die Wartung; (4) bei der Schaffung von großen Stichproben zu erleichtern; und 5) Fülle der phänotypischen und ökologisch-relevante Endpunkte verfügbar zum Testen11,12,13,14,15,16,17 .
Mehrere Labore11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 sind jetzt mit D. Melanogaster als ein Wirbeltier modellalternative für Toxizitätstests um zu verstehen, die Auswirkungen der Luftverschmutzung auf den Menschen. Lokale wilde Arten von Drosophila genutzt werden, ebenso wie Toxizität Modelle für Tiere (und Menschen), ökologisch zu beantworten-, verhaltensorientierte-, und evolutionär relevante Fragen auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation. Arten innerhalb der Gattung Drosophila als Modell verwenden, sind mehrere messbare Endpunkte möglich11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Darüber hinaus mit dem Drosophila -Modell, Toxikologen können: 1) ethisch link Effekte auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation; (2) übernehmen Sie die Rolle der aufstrebenden Faktoren und Entwicklung; (3) Studie ökologisch wichtige Endpunkte (neben medizinisch wichtige Endpunkte); (4) testen Sie gleichzeitig mehrere Stressoren; (5) und langfristigen Test Mehrgenerationen (z. B. evolutionäre und transgenerationalen) Auswirkungen von Stressoren. Daher ermöglicht die Verwendung von Drosophila als Modellsystem eine Vielzahl von Ansätzen, nicht beschränkt auf mechanistische Ansätze mit Inzucht Stämme von D. Melanogaster im Labor zu studieren.
In diesem Papier stellen wir die Methoden für die Aufzucht und das Sammeln von Drosophila um verschiedenen toxikologischen Fragestellungen zu beantworten. Genauer gesagt, wir beschreiben die Methodik für 1) Aufzucht Drosophila in Medium geschnürt mit einem oder mehreren Schadstoffen; (2) sammeln von Drosophila während der Entwicklung (z.B. Wandern, dritte Instar Larven, pupal Fällen neu geschlüpften Erwachsene und Reife Erwachsene); und 3) Aufzucht Drosophila kontaminierten Mittel-bis Test zwischen den Generationen sowie Tradierung und evolutionären Auswirkungen der vergiftendes Langzeitexposition. Mit diesem Protokoll, frühere Autoren18,19,20,21,22,23,24haben,25 berichtet verschiedene physiologische, genetische und Verhaltensstörungen Effekte von Entwicklungsstörungen führen (Pb2 +) Belichtung. Dieses Protokoll ermöglicht Toxikologen einen ganzheitlicheren toxikologischen Ansatz verwenden, der ist für das Verständnis, wie Schadstoffe sind Risikofaktoren für Mensch und Tier in einer zunehmend belasteten Umwelt.

<table><tbody><tr><td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td><td>Carolina Biological</td><td>173204</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-116SB</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td><td>Genessee Scientific</td><td>49-102</td><td>Used to store flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, trays only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-124</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td><td>Genessee Scientific</td><td>32-126</td><td>Used to organize populations of flies</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-312D</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-409-17C</td><td>Useful for storage of contaminants</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-287-150</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-683-708</td><td>Used to prepare medium</td></tr><tr><td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-114</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Flystuff foot valve</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-121</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-124G</td><td>Used to anesthetize flies</td></tr><tr><td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td><td>VWR</td><td>97064-130</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td><td>Walmart</td><td>Not applicable</td><td>Used to make a morgue</td></tr><tr><td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inbred or wildtype line of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>Bloomington &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center at Indiana University</td><td></td><td>https://bdsc.indiana.edu</td></tr><tr><td>Wild popultions of &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;</td><td>UC San Diego &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Stock Center</td><td></td><td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Emergente Eigenschaften und externe Faktoren (Bevölkerung und Ökosystem-Ebene Wechselwirkungen, insbesondere) spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte, obwohl sie nur selten in toxikologischen Studien betrachtet werden. D. Melanogaster entsteht Toxikologie Modellcharakter für die Verhaltensstörungen, neurologischen und genetische Auswirkungen von Schadstoffen, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus können Arten der Gattung Drosophila als Modellsystem für eine integrative Framework-Ansatz emergente Eigenschaften zu integrieren und ökologisch relevante Fragen in der toxikologischen Forschung genutzt werden. Das Ziel dieser Arbeit soll ein Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe als Modellsystem für eine Reihe von phänotypischen Ausgänge und ökologisch relevante Fragen verwendet werden. Genauer gesagt, dieses Protokoll kann zur 1) mehrere biologische Organisationsebenen zu verknüpfen und die Auswirkungen von Schadstoffen auf beide einzelnen und Populationsebene Fitness; (2) testen Sie die Auswirkungen von Schadstoffen in verschiedenen Stadien der Entwicklung Exposition; (3) Test Mehrgenerationen und evolutionären Auswirkungen der Schadstoffe; und 4) gleichzeitig mehrere Schadstoffe und Stressoren zu testen.

Durch mündlich belichten Drosophila Verunreinigung(s) während der gesamten Entwicklung, können verschiedenen toxikologische Fragestellungen getestet werden, indem man Drosophila auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation. In diesem Abschnitt werden repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls in zuvor veröffentlichten Papiere23,24. Dieses Protokoll war insbesondere zur Bewertung d...

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Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In diesem Papier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe mit dem Ziel der Untersuchung der Auswirkungen der Exposition zu einer Reihe von phänotypischen Ausgänge in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und für mehr als eine Generation.

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

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Serie: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Entwicklungsbiologie

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie vo

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Verhalten

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Geschmackspräferenz Assay für Erwachsene<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent years. However, studies that elucidate the underlying mechanisms for ZnO NP-induced toxicity are scanty. We determined the toxicity profiles of ZnO NPs using both in vitro and in vivo experimental models. A significant decrease in cell viability was observed in ZnO NP-exposed MRC5 lung fibroblasts, showing that ZnO NPs exert cytotoxic effects. Similarly, interestingly, gut exposed to ZnO NPs exhibited a dramatic increase in reactive oxygen species levels (ROS) in the fruit fly Drosophila. More in-depth studies are required to establish a risk assessment for the increased usage of ZnO NPs by consumers.

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

We describe a detailed protocol for evaluating the toxicological profiles of zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) in particular, the type of cell death in human MRC5 lung fibroblasts and ROS formation in the fruit fly Drosophila.

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Immunologie und Infektion

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medizin

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Bewertung der chemischen Toxizität bei adulten Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Drosophila Erwachsene olfaktorischen Schock Learning

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

Funktionelle Analyse der Larvenfütterung Circuit in Drosophila

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

Eine erschwingliche und effiziente "hausgemachte" Plattform für Drosophila-Verhaltensstudien und ein begleitendes Protokoll für die mitochondriale Respirometrie von Larven

Geschmackspräferenz Assay für Erwachsene

Toxizitätsstudie von Zinkoxid-Nanopartikeln in der Zellkultur und bei Drosophila melanogaster

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

Bewertung der chemischen Toxizität bei adulten Drosophila melanogaster