Diese Publikation wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Bildungsministerium (PR-Preis #P031C160025-17, Titel des Projekts: 84,031 C) an der Colorado State University-Pueblo (CSU-Pueblo) Gemeinschaften zu bauen aktiv STEM Engagement (C-BASE). Wir bedanken uns bei aktuellen Zoologie und Elsevier für die Bereitstellung der Nutzungsrechte an die repräsentativen Ergebnisse veröffentlicht in früheren Arbeiten, sowie die Redaktion des Jupiter für bietet uns die Gelegenheit, dieses Protokoll zu veröffentlichen. Wir möchten auch die C-BASE Programm, Dr. Brian Vanden Heuvel (C-BASE und Institut für Biologie, CSU-Pueblo), CSU-Pueblo-Biologie-Abteilung, danke Thomas Graziano, Dr. Bernard Possidente (Institut für Biologie, Skidmore College) und Dr. Claire Varian Ramos (Institut für Biologie, Kolorado Landesuniversität-Pueblo) für ihre Unterstützung und Hilfe.

Das folgende Protokoll ist ein experimentelles Protokoll verwendet, um die Arten der Gattung Drosophila auf kontaminierten Medium hinten, bei oraler Einnahme eines Toxins geeignet ist; andere Formen der Belichtung sind möglich mit Drosophila Modell11,15,16,26. In diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden zuvor von Hirsch Et Al. beschrieben 19 und Peterson Et al. 23 , 24 , 25.
1. richten Sie Lager Populationen von Drosophila im Forschungslabor
<ol><li>Richten Sie eine ökologisch kontrollierten Inkubator (oder kleine Zimmer) Haus Lager Populationen von Drosophila durch Festlegen der Inkubatoren für eine Konstante Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Luftfeuchtigkeit, je nach den Vorlieben der Testspezies. Hinweis: Bevorzugte Umweltbedingungen variieren abhängig von den einheimischen Ökologie der Arten für die Studie ausgewählt. Z. B. D. Melanogaster stammt aus Sub-Sahara Afrika27 und bleibt in der Regel bei 25 ° C, 12:12-Licht: Dunkel-Zyklus und ca. 60 % Luftfeuchtigkeit16,18,19,20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 28 , 29 , 30. auf der anderen Seite D. Montana reicht in den meisten Teilen von Kanada und den USA Mittlerer Westen, einer sehr viel kälteren Region; D. Montana wird daher in der Regel auf 19 – 20 ° C und manchmal eine leichte 24 h-Regime zu simulieren, während der fügenden Jahreszeit31gehalten. Für eine detailliertere Beschreibung der geografischen Bereiche von verschiedenen Arten von Drosophilasiehe die Drosophila Speziation Muster Webseite32.</li>
	<li>
Entweder ein Lager-Center eine bevorzugte Drosophila -Arten und/oder Inzuchtlinie einzuholen (siehe Tabelle der Materialien), ein weiteres Forschungslabor auf Anfrage oder sammle Wild, genetisch Variable Populationen aus dem Feld. Hinweis: Die folgenden Schritte erläutern die Methoden um wilde, genetisch Variable Populationen von Drosophila weiterhin im Forschungslabor zu sammeln. Diese Methoden sind von Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 geändert worden, um die größte Artenvielfalt auf einmal anstatt besondere Zielarten mit einem Köder Quelle erfassen.<ol>
<li>Ein halbes Dutzend Reife Bananen in der Tiefkühltruhe über Nacht Einfrieren und Auftauen vor dem Köder fallen.</li>
		<li>Bereiten Sie mehrere 1 – 2 L Kunststoff-Flaschen durch Schneiden einen u-förmigen Schlitz an der Vorderseite der Flasche, fliegt in den Köder Flasche und nicht Flucht erfasst werden können. Cap die Kunststoff-Flaschen mit ihren Kronkorken, damit die fliegen über die Lider nicht entgehen.</li>
		<li>Fügen Sie die aufgetaute Banane auf den Boden der Flaschen, so dass der Boden der Flaschen ungefähr ein Zoll Banane enthält. Legen Sie eine Scheibe Reife Tomate in der Flasche. Fügen Sie einen Hefe-Slurry (den übrig gebliebenen Hefen den Herstellungsprozess Bier) die Banane an der Unterseite der Flasche, so dass die Banane bekommt in der Hefe Brei einweichen.</li>
		<li>Fügen Sie hinzu, Holzstäbchen (in aufrechter Position vertikale) in die Flasche damit die fliegen ein sauber Substrat von der Hefe Gülle und Banane auf Weg zu gehen. Abbildung 1 zeigt das Endprodukt dieser Methoden.</li>
		<li>Hängen Sie Köder Flaschen in den Bäumen über Nacht und überprüfen Sie, ob alle 24 h. Mund Absaugen aus Flaschen fliegt und individuell Weibchen in Fläschchen mit Mittel-bis Iso-weiblichen Linien zu erstellen. Hinweis: Multi-weibliche Linien, allerdings entstehen nur dann, wenn die Weibchen der einzelnen Arten eindeutig identifiziert werden können. Darüber hinaus fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche diätetische Anforderungen je nach diesen Nischen (Werner und Jaenike34); Siehe Werner und Jaenike34 für Diät-Empfehlungen und Rezepte.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Erwachsenen F1 Nachkommen unter dem Mikroskop Dissektion um die Arten der gesammelten Drosophila zu identifizieren (siehe Markow und O'Grady33 und Werner und Jaenike34 für Hilfe bei der Identifizierung von verschiedenen Arten ).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig1.jpg"> Abbildung 1 : Bildliche Darstellung von fallen und Köder verwendet, um wilde Populationen von Drosophila im Feld sammeln. (A) Fly fallen auf ein lokales Feld Standort in Colorado. (B) ein näher Blick auf die Fliegen fallen auf dieser Wiese. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="3"><li>Pflegen Sie das Iso-Weibchen oder die Multi-weiblichen Linien in einem ökologisch kontrollierten Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur, Licht: Dunkel-Zyklus und Feuchtigkeit. Um dies zu tun, Haus fliegt in Fläschchen oder Flaschen in Medium bevorzugt und die trächtigen Weibchen zur Eiablage in das Medium zu ermöglichen. Überwachen Sie die Fläschchen auf das Vorhandensein von Larven und Puppen. Hinweis: Fliegen innerhalb der Gattung Drosophila unterschiedliche ökologische Nischen besetzen und haben unterschiedliche Ernährungsbedürfnisse und Umwelt abiotischen Vorlieben abhängig von diesen Nischen33,34. Ökologische Präferenzen und Ernährungsempfehlungen (und weitere Anweisungen auf Fliege Tierhaltung) finden Sie in Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30Markow und O'Grady33und Werner und Jaenike34. Wenn Wildfänge Arten verwenden, können lokale Umweltbedingungen in den Inkubatoren simuliert werden, bis die Spezies identifiziert werden können.</li>
	<li>Übertragen Sie Aktien häufig auf frisches Medium, gesunde Linien zu erhalten und vermeiden Infektion durch Milben alten Fläschchen zu verwerfen. Hinweis: Die Häufigkeit der Übertragung hängt von den Lebenszyklus der Art. Übertragen Sie Drosophila Melanogaster werden z. B. alle 2 Wochen auf frisches Medium. Weitere Informationen zur Verwaltung von Linien im Labor, siehe Rand Et Al. 16, Elgin und Miller28, Shaffer Et Al. 29, Stocker und Gallant30, Greenspan35und naturwissenschaftliche Bildung Datenbank36.</li>
</ol>(2) hinten Drosophila kontaminierten Mittel-
Hinweis: Wenn Drosophila im Labor zum ersten Mal oder mit einem neuen Verunreinigung(s) testen, identifizieren die letale Dosis (siehe Castaneda Et Al. 37 und Massie Et al. 38 für Methoden) und die LD50 (siehe Castaneda Et Al. 37 und Akins Et Al. 39 für Methoden) erste. Führen Sie dann eine Dosis-Wirkungs-Kurve, um biologisch relevante Konzentrationen für die gewünschte phänotypischen Ausgabe zu identifizieren; sehen Sie Hirsch Et Al. 19 und Zhou Et Al. 40 für Methoden.
<ol><li>Vorbereiten des kontaminierten Mediums auf die gewünschte konzentrasion(s), abhängig von der Chemie der Verunreinigung auf lagerlösungen. Hinweis: zum Beispiel, um Stammlösungen PbAc vorbereiten: Stammlösungen Bleiacetat (PbAc) Medium indem Verunreinigung zu destilliertem Wasser (dH20) bis Medium gemacht mit Wasser erreicht gewünschte Schadstoffkonzentration vorzubereiten. Zum Beispiel eine Stammlösung von 1.000 µM PbAc, können werden vorbereitet, indem man PbAc, dH20 bis 1.000 µM erreicht PbAc. Stammlösung (z.B. die 1.000 µM PbAc Lösung) weiter, um die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 500 µM PbAc) und pflegen diese Lösungen als Lager als auch.</li>
	<li>Bereiten Sie Medium, folgende Herstellerangaben als das Steuermedium dienen. Zusätzliche Mittel, folgende Herstellerrichtlinien vorzubereiten; jedoch bereit Ergänzung Verunreinigung Lösung für dH20. Hinweis: zum Beispiel, wenn Nu Drosophila Medium verwenden, fügen Sie etwa einen Teelöffel instant Medium zu einem Kunststoff-Fläschchen hinzu. Das Medium ca. 5 – 5,5 mL dH20 hinzufügen. Streuen Sie ein paar Körner live Bäckerhefe Steuermedium vorzubereiten. Zur Vorbereitung der experimentellen Mittel ergänzen die Stammlösung (z. B. 500 µM PbAc) für dH20.</li>
	<li>
Übertragen Sie reproduktiv lebensfähigen Reife Männchen und Weibchen aus Lager Populationen in der Kontrolle und dem experimentellen Medium. Hinweis: Die Zeit nach dem bewegungsapparate, Geschlechtsreife unterscheidet zwischen der Drosophila -Arten-41.<ol>
<li>Klopfen Sie leicht das Fläschchen Lager fliegen nach unten mit der dominanten Hand. Stellen Sie sicher, dass die fliegen automatisch an das Ende des Röhrchens verschieben. Entfernen Sie mit der anderen Hand die Kappe des Fläschchens beim Tippen auf das Fläschchen und legen Sie ein frisches Fläschchen oder verunreinigte Medium auf das Fläschchen mit den fliegen. Halten Sie die Fläschchen zusammen und drehen Sie sie um, leichtes Klopfen, so dass die fliegen automatisch auf das frische Fläschchen oder verunreinigte Medium übertragen werden. Während noch Antippen der Durchstechflasche mit dem fliegen, Kappe das Fläschchen.</li>
		<li>Wiederholen Sie mit mehr Fläschchen, und achten Sie auf die Anzahl der fliegen in jedes Fläschchen zu standardisieren. Hinweis: Die Gesamtzahl der Erwachsenen übertragen über einzelne Übertragung oder Anästhesie hängt die Größe der Ampullen verwendet, um eine Überfüllung zu vermeiden.</li>
		<li>Brüten Sie Erwachsene in einem standard ökologischen Zustand (d. h. ein Inkubator) und ermöglichen Sie die Erwachsenen, paaren sich und legen ihre Eier in das Medium für 24 / 96 h.</li>
		<li>Nach 24 – 96 h, verwerfen Erwachsene in einem Leichenschauhaus (eine Flasche gefüllt mit Mineralöl und begrenzt mit einem eng anliegenden Trichter) hinterließ befruchtete Eier (die später die Versuchspersonen werden) zu Testzwecken Reifen. Legen Sie die Fläschchen in den Inkubator ermöglicht die Eier zu entwickeln.</li>
		<li>Überwachen Sie die Fläschchen für wandernde Instar Larven durch auf der Suche nach Larven, die aus dem Medium zu entwickeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sammeln von Versuchspersonen in verschiedenen Entwicklungsstadien
Hinweis: Versuchspersonen können in jedem Entwicklungsstadium, platziert in den blinden codierten 15 mL konische Röhrchen und getestet für die Akkumulation gesammelt werden. Methoden zur Prüfung der Ansammlung von Verunreinigungen hängt von der Verunreinigung untersucht. Zum Beispiel kann Ansammlung von PbAc mit Inductively-Coupled Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS)42getestet werden. Darüber hinaus können die Versuchspersonen in jeder Entwicklungsphase für eine Vielzahl von phänotypischen Effekten von Verunreinigungen getestet werden gesammelt werden. Abbildung 2 veranschaulicht die Drosophila -Life-Cycle-43. Abbildung 3 illustriert das experimentelle Protokoll für die Belichtung und die verschiedenen Entwicklungsstadien für Sammlung.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig2.jpg"> Abbildung 2 : Konzeptionelle Übersicht über den gesamten Lebenszyklus von D. Melanogaster (das am häufigsten verwendete Drosophila Modellsystem). Die Phasen des Lebenszyklus von Drosophila sind: (1) Ei, Larve (2) erste Instar, 3) zweiten Instar Larve, (4) dritte Instar Larve, 5) dritte Instar Larve, Wandern (6) White-eye Puppe, 7) rote-Augen-Puppe, 8) neu-geschlüpften Erwachsenen und 9) älterer Erwachsener. <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57450/57450fig3.jpg"> Abbildung 3 : Grundlegende Übersicht der Methoden zur Aufdeckung von Drosophila Oral kontaminierten Medium in der elterlichen (F-0) und die nachfolgenden Generationen (F1 und höher). (A) Methoden für die orale Exposition während der Entwicklung in der exponierten Generation. (B) Methoden der Übertragung von Kontaminanten an Nachkommen (F1 bis die gewünschte Generation) zu testen. Diese Zahl wurde von Peterson Et Al. modifiziert 24 <a href="/files/ftp_upload/57450/57450fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol><li>
Wandern-dritte Instar Larven sammeln
	<ol>
<li>Starten Sie die Überwachung Fläschchen, wenn Lichter in den Inkubator einschalten Larven werden vom Medium entstehen und bewegen sich nach oben auf der Seite das Fläschchen in ein h nach Schalten Sie Lichter im Inkubator. Innerhalb dieser h entfernen Sie Bummel durch Dritte Instar Larven von den Seiten des Fläschchens sorgfältig mit einem Holzstab oder einer Pinzette Hinweis: Die Anzahl der Larven abholbereit hängt von der Anzahl der Eier in "2.3.4".</li>
		<li>Um überschüssige Mittel aus den Larven zu entfernen, legen Sie die Larven in einen kleinen Becher mit dH2O. Pour dH2O aus dem Becher und die Larven auf eine heikle Aufgabe Wischer. Entfernen Sie mit einer heiklen Aufgabe Wischer, vorsichtig die überschüssige dH2O aus die Larven.</li>
		<li>Pflegen Sie experimentellen Populationen im Brutkasten ökologisch kontrolliert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammeln Sie neu geschlüpften Erwachsene
	<ol>
<li>Monitor-Fläschchen für bewegungsapparate anhand der Färbung der Puppen entlang der Seiten des Vials. Hinweis: Während der Entwicklung werden Puppen dunkler. Entwicklungszeit, besonders vor bewegungsapparate hängt von der Spezies getestet.</li>
		<li>Wenn die ersten Erwachsenen zu Eclose beginnen, dump und entsorgen Sie diese Erwachsenen in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl.</li>
		<li>Wenn die Lichter in den Inkubator am nächsten Morgen einschalten, dump und verwerfen alle Erwachsenen unbekannt Alter (oder Jungfräulichkeit), die geschlüpften über Nacht oder während der Morningbefore Lichter haben können, auf.</li>
		<li>Ca. 4 h später, alle Erwachsenen, die sich als neu geschlüpften Erwachsene mit einer CO2 Pistole in das Fläschchen zu betäuben. Legen Sie Erwachsene auf einen CO2 Teller unter dem Mikroskop Dissektion. Sex Erwachsene durch auf der Suche nach Sex Kämme auf die Vorderbeine der Männchen und Renderbild bei Frauen. Hinweis: D. Melanogaster muss innerhalb von 6 h des bewegungsapparate Paarung vermeiden gesammelt werden aber andere Arten können mehr Entwicklungs-Zeiten haben (und daher auch nicht innerhalb dieses Zeitrahmens gesammelt werden müssen).</li>
		<li>Separate Erwachsene auf dem CO2 Teller mit einem Holzstab. Erwachsene in geschlechtsspezifische Gruppen mit einem Holzstab auf die mittlere passenden vorbestehenden Geschichte sanft zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Post-bewegungsapparate Reife Erwachsene zu sammeln
	<ol>
<li>Können Sie Erwachsene auf die mittlere passenden Pre bewegungsapparate Exposition gegenüber Eistadium auf das gewünschte Alter Post-bewegungsapparate im Brutkasten ökologisch kontrolliert bleiben.</li>
		<li>Übertragen Sie Erwachsene auf das Steuermedium für 24 h vor der Prüfung damit Erwachsene, überschüssige kontaminierten Medium ihre Körper pflegen können einzeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) hinten Versuchspersonen, die Auswirkungen der Mehrgenerationen oder transgenerationalen Belichtung zu testen.
<ol><li>Um die elterliche Generation (aka P0 oder F0 Generationen) hinten, übertragen Sie Erwachsene aus Lager Populationen zu kontrollieren und das experimentelle Medium nach den Schritten in "2.1" auf "2.3" und "3.1" auf "3.3".</li>
	<li>Wenn die Erwachsenen reproduktiv reif sind (siehe Pitnick Et Al. 41), einzeln Transfer (lt. 2.3.1) ein Fläschchen von Männern zu einem frischen Fläschchen der Kontrolle oder experimentelle Medium. Übertragen Sie eine Durchstechflasche Weibchen auf frisches Fläschchen, das Männchen jetzt enthält einzeln. Ermöglichen Sie Erwachsenen, Paaren und Eier legen in das Medium für 24-96 h Dump und verwerfen Sie Erwachsene in einem Leichenschauhaus mit Mineralöl zu und neu inkubieren Sie Fläschchen um Nachwuchs zu ermöglichen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.2 abhängig von der gewünschten Anzahl der Generationen.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Drosophila Melanogaster wurde als ein leistungsfähiges Modell für eine Reihe von biologischen Prozessen aufgrund der umfangreichen Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen13,14gegründet. Aus den gleichen Gründen ist es ein leistungsfähiges Modell für die medizinische Wissenschaft hat Drosophila als geeignete Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen der anthropogenen Umweltverschmutzung auf eine Reihe...

Jedes Jahr werden rund 1.000 neue Chemikalien durch die chemische Industrie1,2eingeführt; Allerdings werden die Umweltauswirkungen der nur ein kleiner Prozentsatz dieser Chemikalien vor Verteilung2,3getestet. Obwohl große Katastrophen ungewöhnlich sind, subletale und chronische Exposition gegenüber einer Vielzahl von Schadstoffen sind weit verbreitet bei Menschen und Tieren4,5. Im historischen Mittelpunkt der Ökotoxikologie und Umwelttoxikologie war testen Letalität, einzelne Exposition gegenüber chemischen Stoffen, akute Exposition und die physiologischen Wirkungen der Exposition, als ein Mittel zur Messung der Auswirkungen von Schadstoffen auf Überleben6, 7 , 8 , 9 , 10. zwar eine Verschiebung hin zu ethischen und nicht-invasive Methoden zu Tierversuchen, aktuelle Ansätze sind begrenzt wegen der Rolle, dass Entwicklung, emergente Eigenschaften und externen Faktoren (z. B. Bevölkerung-Ebene und ökosystemebene Wechselwirkungen) spielen bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte8. Daher gibt es einen Bedarf an Methoden, die einen ganzheitlichen Ansatz zu integrieren, ohne Einbußen bei der Tier-und Pflanzenwelt und/oder Wirbeltiere im Labor.
Wirbellosen Modellsysteme wie Drosophila Melanogaster, sind eine attraktive Alternative zu der Notwendigkeit einen ganzheitlicheren Ansatz zu Toxizitätstests befassen. D. Melanogaster, wurde ursprünglich als ein Wirbellosen Modellsystem für menschliche genetische Forschungen vor etwa einem Jahrhundert entwickelt11. D. Melanogaster prominent dient heute als ein Wirbeltier modellalternative aus mehreren Gründen: 1) die Erhaltung der Gene und Wege zwischen D. Melanogaster und Menschen; (2) kurze Generationszeit im Vergleich zu fest gefügten Modellen; (3) günstige Kosten für die Wartung; (4) bei der Schaffung von großen Stichproben zu erleichtern; und 5) Fülle der phänotypischen und ökologisch-relevante Endpunkte verfügbar zum Testen11,12,13,14,15,16,17 .
Mehrere Labore11,15,16,17,18,19,20,21,22, 23 , 24 , 25 sind jetzt mit D. Melanogaster als ein Wirbeltier modellalternative für Toxizitätstests um zu verstehen, die Auswirkungen der Luftverschmutzung auf den Menschen. Lokale wilde Arten von Drosophila genutzt werden, ebenso wie Toxizität Modelle für Tiere (und Menschen), ökologisch zu beantworten-, verhaltensorientierte-, und evolutionär relevante Fragen auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation. Arten innerhalb der Gattung Drosophila als Modell verwenden, sind mehrere messbare Endpunkte möglich11,15,16,18,19,20 ,21,22,23,24,25. Darüber hinaus mit dem Drosophila -Modell, Toxikologen können: 1) ethisch link Effekte auf mehreren biologischen Ebenen der Organisation; (2) übernehmen Sie die Rolle der aufstrebenden Faktoren und Entwicklung; (3) Studie ökologisch wichtige Endpunkte (neben medizinisch wichtige Endpunkte); (4) testen Sie gleichzeitig mehrere Stressoren; (5) und langfristigen Test Mehrgenerationen (z. B. evolutionäre und transgenerationalen) Auswirkungen von Stressoren. Daher ermöglicht die Verwendung von Drosophila als Modellsystem eine Vielzahl von Ansätzen, nicht beschränkt auf mechanistische Ansätze mit Inzucht Stämme von D. Melanogaster im Labor zu studieren.
In diesem Papier stellen wir die Methoden für die Aufzucht und das Sammeln von Drosophila um verschiedenen toxikologischen Fragestellungen zu beantworten. Genauer gesagt, wir beschreiben die Methodik für 1) Aufzucht Drosophila in Medium geschnürt mit einem oder mehreren Schadstoffen; (2) sammeln von Drosophila während der Entwicklung (z.B. Wandern, dritte Instar Larven, pupal Fällen neu geschlüpften Erwachsene und Reife Erwachsene); und 3) Aufzucht Drosophila kontaminierten Mittel-bis Test zwischen den Generationen sowie Tradierung und evolutionären Auswirkungen der vergiftendes Langzeitexposition. Mit diesem Protokoll, frühere Autoren18,19,20,21,22,23,24haben,25 berichtet verschiedene physiologische, genetische und Verhaltensstörungen Effekte von Entwicklungsstörungen führen (Pb2 +) Belichtung. Dieses Protokoll ermöglicht Toxikologen einen ganzheitlicheren toxikologischen Ansatz verwenden, der ist für das Verständnis, wie Schadstoffe sind Risikofaktoren für Mensch und Tier in einer zunehmend belasteten Umwelt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Carolina Biological Instant Drosophila Medium Formula 4-24</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>173204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila vials, Narrow (PS), Polystyrene, Superbulk, 1000 vials/unit</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-116SB</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flugs Closures for vials and bottles, Narrow plastic vials</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>49-102</td>
			<td>Used to store flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, trays only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-124</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardboard trays, dividers only, narrow</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>32-126</td>
			<td>Used to organize populations of flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Square Wide-Mouth HDPE Bottles with Closure</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-312D</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Color-Coded LDPE Wash Bottles</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>03-409-17C</td>
			<td>Useful for storage of contaminants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Repeater M4 Manual Handheld Pipette Dispenser</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>14-287-150</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced Pipetter Tips - Standard, Eppendorf Quality Tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>13-683-708</td>
			<td>Used to prepare medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad, Standard Size (8.1 X 11.6cm)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff foot valve</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing, green (1 continguous foot/unit)</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-124G</td>
			<td>Used to anesthetize flies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil, Light, White, High Purity Grade, 500 mL HDPE Bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-130</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Erlenmeyer Flask Set - 3 Sizes - 50, 150 and 250ml, Karter Scientific 214U2</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Used to make a morgue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BGSET5 Glass Beaker Set Of 5</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inbred or wildtype line of Drosophila</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center at Indiana University</td>
			<td></td>
			<td>https://bdsc.indiana.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wild popultions of Drosophila</td>
			<td>UC San Diego Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td>https://stockcenter.ucsd.edu/info/welcome.php</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental protocol for using drosophila as an invertebrate model system for toxicity testing in the laboratory

Emergente Eigenschaften und externe Faktoren (Bevölkerung und Ökosystem-Ebene Wechselwirkungen, insbesondere) spielen eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von ökologisch wichtigen Endpunkte, obwohl sie nur selten in toxikologischen Studien betrachtet werden. D. Melanogaster entsteht Toxikologie Modellcharakter für die Verhaltensstörungen, neurologischen und genetische Auswirkungen von Schadstoffen, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus können Arten der Gattung Drosophila als Modellsystem für eine integrative Framework-Ansatz emergente Eigenschaften zu integrieren und ökologisch relevante Fragen in der toxikologischen Forschung genutzt werden. Das Ziel dieser Arbeit soll ein Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe als Modellsystem für eine Reihe von phänotypischen Ausgänge und ökologisch relevante Fragen verwendet werden. Genauer gesagt, dieses Protokoll kann zur 1) mehrere biologische Organisationsebenen zu verknüpfen und die Auswirkungen von Schadstoffen auf beide einzelnen und Populationsebene Fitness; (2) testen Sie die Auswirkungen von Schadstoffen in verschiedenen Stadien der Entwicklung Exposition; (3) Test Mehrgenerationen und evolutionären Auswirkungen der Schadstoffe; und 4) gleichzeitig mehrere Schadstoffe und Stressoren zu testen.

Durch mündlich belichten Drosophila Verunreinigung(s) während der gesamten Entwicklung, können verschiedenen toxikologische Fragestellungen getestet werden, indem man Drosophila auf verschiedenen Ebenen der biologischen Organisation. In diesem Abschnitt werden repräsentative Ergebnisse unter Verwendung dieses Protokolls in zuvor veröffentlichten Papiere23,24. Dieses Protokoll war insbesondere zur Bewertung d...

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Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In diesem Papier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe mit dem Ziel der Untersuchung der Auswirkungen der Exposition zu einer Reihe von phänotypischen Ausgänge in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und für mehr als eine Generation.

Experimentelles Protokoll für die Verwendung von Drosophila als ein Wirbellosen Modellsystem für Toxizitätstests im Labor

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

12.6K Aufrufe.  Colorado State University-Pueblo. In diesem Papier bieten wir ein detailliertes Protokoll für das Verfügbarmachen von Arten der Gattung Drosophila Schadstoffe mit dem Ziel der Untersuchung der Auswirkungen der Exposition zu einer Reihe von phänotypischen Ausgänge in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und für mehr als eine Generation.

Serie: Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Testen Nikotin Toleranz in Blattläuse mit einer künstlichen Diät Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Forschung

Biologie

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protokolle für die Prüfung der Toxizität von neuartigen Insektizide Chemikalien, Mücken

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

Ein Luft-Flüssig-Interface-Bronchial-Epithelmodell für realistische, wiederholte Inhalationsexposition gegenüber Luftpartikeln für Toxizitätstests

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...