Si ringrazia F. Camargo per il dono di tetO-YAPS127A topi; R26-rtTAM2 topi (stock #006965) sono stati acquistati presso il laboratorio di Jackson. Ringraziamo Chiara Frasson e Giuseppe Basso per aiuto con le procedure di FACS. Questo lavoro è supportato da AIRC speciale programma oncologia molecolare clinica ' 5 per mille ' e un PI-Grant AIRC per s. p ed Epigenetics Flagship progetto CNR-Miur concede a S.P. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) sotto ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea e il programma per l'innovazione (di sovvenzione DENOVOSTEM n. 670126).

<ol>
	<li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem/Progenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP/TAZ.">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li><li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage.">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li><li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+strategies,+mechanisms,+and+applications.">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration.">Stem cell plasticity. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates.">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li><li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia.">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li><li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage.">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li><li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration.">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li><li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YAP/TAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration.">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li><li>Pan, F. 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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui presentiamo i protocolli per riprogrammare le cellule epiteliali ex vivo terminalmente differenziate dei tessuti differenti in loro corrispondente tessuto-specifica del progenitor (o ySCs) di espressione transiente di YAP, come riferito precedentemente1. Noi abbiamo dettagliato due procedure: uno che consente la riprogrammazione delle cellule di FACS-purificato con vettori lentivirali e una seconda che evita l'infezione virale e si avvale di transgenici YAP espressione. Ogni protocollo presenta una strategia efficace per isolare e cellule differenziate primario di cultura e una strategia per forzare esogeno YAP espressione genica in cellule differenziate, generando de novo tessuto-specifici espandibile cellule staminali somatiche (Vedi schemi in figure 1A e 2A).
Abbiamo dimostrato che le strategie di isolamento qui presentate efficacemente isolare una popolazione pura di cellule differenziate, come dimostrato dal fatto che non abbiamo mai rilevato qualsiasi escrescenza da campioni di controllo negativo (figure 1 e 2 C).
I vettori lentivirali utilizzati in questo studio per la riprogrammazione delle cellule mammarie primarie di LD sono doxiciclina inducibile, offrendo la possibilità di uno stretto controllo dell'espressione del transgene; Questo permette di accendere e fuori esogeno YAP espressione a volontà. Particolare attenzione deve essere posto in evitando l'uso di un titolo virale eccessivo, come questo può essere dannoso in termini di efficienza di riprogrammazione. Nel caso di cellule acinose primarie, siamo passati ad un approccio completamente transgenico per ottenere una riprogrammazione di YAP-dipendente con manipolazioni minime. Questa strategia di quest'ultima inoltre è particolarmente adatta a primario dei acini pancreatici, come cluster acinose isolato sono molto fragili e scarsamente suscettibili di infezione lentivirale. La strategia transgenica impiegata offre lo stesso vantaggio di doxiciclina-dipendente vettori lentivirali per il controllo stretto dell'espressione genica. Inoltre, la strategia transgenica sfruttata con acini pancreatici primari porta il vantaggio aggiuntivo di un efficienza riprogramma molto più alta per la riprogrammazione indotta da virale delle cellule mammarie di LD. Oltre la plasticità intrinseca diversa associata a cellule derivate dai tessuti differenti, il più alto tasso di riprogrammazione del pancreas potrebbe essere derivato dalla maggiore efficienza di espressione associata all'espressione di YAP uniforme e autonoma in tutte le cellule espiantate. In particolare, abbiamo dimostrato che YAP esogeno non è più necessaria dopo la generazione del ySCs (colonie di yMaSC e yDucts), senza compromettere la loro capacità di auto-rinnovamento. Questo è perché ySCs riattivazione endogena YAP/TAZ e utilizzarli per il auto-rinnovamento quando esogeno YAP è spento1.
Abbiamo validato la nozione che ySCs emergono infatti da cellule differenziate controllando la cellula dell'origine dei nostri esperimenti riprogrammazione tramite genetica lignaggio traccia convalide1.
Ampia caratterizzazionedi ySCs Mostra che indotta da YAP riprogrammazione genera SCs somatiche normale1 come mi) a livello di trascrittomica, ySCs visualizzare massicce sovrapposizioni con SCs nativo; II) ySCs visualizzare potenziale differenziativo e può generare una progenie multilineare sempre limitata all'identità del loro tessuto di origine; III) ySCs sono non trasformate e non tumorigeniche quando trapiantate in vivo.
Qui descriviamo anche procedure per mantenere ed espandere la cultura sia yMaSCs e yDucts come organoids incorporato in idrogel di matrice della membrana dello scantinato di 100%. Queste condizioni consentono l'auto-organizzazione dei ySCs in organoids tridimensionali che assicurano il mantenimento delle proprietà di staminalità a lungo termine nella cultura, consentendo di espandere queste derivano popolazioni a volontà per analisi successive e applicazioni. Per ragioni sconosciute, non siamo riusciti a ottenere yMaSC organoids inserendo LD cellule direttamente in condizioni di coltura organoid infette 7 giorni dopo il trattamento doxiciclina nella piastra di coltura del tessuto plastica; in altre parole, il passaggio intermedio di crescita in condizioni di Colonia mammaria è essenziale. Nelle nostre mani, anche nativi popolazione richiedono condizioni di Colonia mammaria prima di passaggio nella cultura organoid. Inoltre, la conseguenza più efficiente di organoid è ottenuta quando noi evitare dissociare le colonie primarie in singole celle, ma piuttosto trasferire le colonie intatte in condizioni di coltura organoid.
Condizioni di coltura organoid sopportare anche il vantaggio di dare la possibilità di crioconservare ySCs, purché l'organoids sono recuperati da loro matrici, evitando la dissociazione di cella prima della crioconservazione in bagno di azoto.
Il YAP riprogrammazione procedura presentata in grado di convertire tipi distinti delle cellule differenziate derivati da diversi tessuti adulti loro corrispondente tessuto-specifici sulle cellule staminali (abbiamo testato utilizzando cellule mammarie, pancreatiche e neuronale)1. A differenza da iPSCs o altri sforzi di riprogrammazione, YAP/indotto SCs può mantenere i ricordi del loro tessuto di origine. Della nota, de-differenziazione delle cellule somatiche in cellule con proprietà simil-staminali è l'unica forma di plasticità di destino delle cellule e riprogrammazione osservati in vivo, per esempio dopo danno di tessuto e di sostenere la cicatrizzazione5,17 , 18 , 19 , 20. è degno di nota che YAP e TAZ sono in gran parte superflui per l'omeostasi normale ma cruciale per riparazione tissutale in molteplici tessuti11,21. Costantemente con una funzione fisiologica della riprogrammazione procedura qui descritta, YAP/TAZ sono stati recentemente indicati per essere richiesto nella rigenerazione intestinale in modelli murini di pazienti di colite ulcerosa causando una conversione delle cellule intestinali adulte in un epitelio di riparazione che visualizza le caratteristiche del budello fetale19. YAP riprogrammazione amplia così le attuali strategie di plasticità indotta delle cellule fornendo un mezzo per generare cellule staminali somatiche, uno stato che è stato finora impegnativo per catturare in vitro. Questo approccio, se esteso anche alle cellule di derivazione umana, potrebbe avere ampia rilevanza da applicazioni di medicina rigenerativa allo studio dello stato somatico staminalità e per l'espansione di somatico stelo cellule in vitro.

Le cellule staminali somatiche tessuto-specifici (SCs) sono critiche per la riparazione e rinnovamento tissutale dopo la ferita. La possibilità di isolare facilmente e illimitatamente espandere ex vivo somatico SCs rappresenta un problema critico per potenziali terapie rigenerative, nonché per applicazioni di SC in ricerca di base e modellazione di malattia. Progressi in questa direzione, tuttavia, sono stato limitato dalla difficoltà di acquisire lo stato di SC di vari organi epiteliali in vitro. Infatti, nei diversi tessuti adulti residenti SCs può non esiste, o non essere prontamente disponibili, o loro numero e del potenziale rigenerativo può essere eroso dalle condizioni di invecchiamento o di malattia. Nel 2016, abbiamo iniziato a colmare questa lacuna segnalando che l'espressione di un singolo coactivator transcriptional, YAP (YES-associated protein) o sue proteine strettamente correlate TAZ (attivatore trascrizionale con un motivo PDZ), nelle cellule terminalmente differenziate in modo efficiente crea popolazioni di cellule funzionali, espandibile, non tumorigeniche, autologo che sono funzionalmente e molecolarmente indistinguibili da loro corrispondente tessuto-specifici SCs1. Un impulso di sostenuta YAP o attività TAZ per pochi giorni è sufficiente per indurre la comparsa di autorinnovanti SCs somatiche. Si tratta di una condizione stabile che non è più dipendente da espressione del transgene continuo, come esso può essere trasmesso attraverso generazioni di cellulari senza ulteriore espressione ectopica YAP/TAZ1. Il protocollo presentato qui dettagli la procedura utilizzata per generare cellule staminali/progenitrici epiteliali de novo del ghiandola mammaria e del pancreas, a partire da cellule differenziate di questi tessuti. Questa procedura si riempie una scatola nera nell'arena riprogrammazione/transdifferenziazione corrente. Gli sforzi principali in queste direzioni hanno infatti finora centrato sulla transizione di cella a uno stato di (iPSC) sulle cellule staminali pluripotenti indotte, seguito dalla conversione di questi embrionali e pluripotenti SCs in cellule più differenziate. Tuttavia, iPSCs sono tumorigeniche una volta introdotto nei tessuti adulti, alzando la necessità di sviluppare protocolli per la loro differenziazione completa ed efficiente2. Tuttavia, questo passaggio di differenziazione, anche quando possibile, è disponibile al prezzo di potenziali ripopolamento a lungo termine dell'organo, auto-organizzazione ed espandibilità. Questi sono gli attributi essenziali per la rigenerazione dell'organo che in realtà sono tipici solo di SCs endogena di tessuto-specifica e di SCs indotta da YAP attualmente descritto (ySCs). Allo stesso modo, transdifferenziazione diretta di tipo di una cella in un altro utilizzando cocktail di trascrizione vari fattori anche generano differenziato cellule che mancano essenziale potenziale proliferativo e staminalità3.
La procedura qui descritta sfrutta anche la tecnologia di recente introduzione organoid, da cui SCs endogena può essere ampliato e differenziato ex vivo4. SCs YAP-indotta può generare SCs organoid-formando anche in condizioni sperimentali, biologico o malattia in cui SCs endogeno non sono presenti. Vorremmo sottolineare che, a differenza con altre procedure di riprogrammazione, il tipo della plasticità delle cellule impartita da YAP può corrispondere all'unica forma di reversione ad uno stato di SC-like che si verifica nei tessuti viventi. Riacquisizione dei tratti di SC-come è stato associato con la riparazione dei tessuti o l'attivazione oncogenica5. Anche se superfluo per l'omeostasi dei tessuti adulti diversi, YAP e/o TAZ sono assolutamente essenziali per la rigenerazione, la crescita del tumore e l'espansione di SCs somatiche in vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1099">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">10 mL sterile syringes</td>
			<td style="width:123px;">Rays</td>
			<td style="width:112px;">10LC</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm&#160; cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">15 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430052</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">24-well ultra low attachment plates</td>
			<td style="width:123px;">Costar</td>
			<td style="width:112px;">3473</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">40 mm cell strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td style="width:112px;">352340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">48-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353078</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">50 mL sterile conical tubes</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">430290</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">6-well multiwell plates</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">353046</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">12634028</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BPE</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>13028014</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Collagenase, type I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>17018029</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">1705-041</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Disposable scalpels</td>
			<td style="width:123px;">Swann-Morton</td>
			<td style="width:112px;">0503</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">11320033</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">DMSO</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">D2650</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DnaseI</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:112px;">11284932001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9891&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">E5134</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol 100%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51976</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FACS tubes (with strainer caps)</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:112px;">352235</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD326 (Ep-CAM)</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">118208</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUdeltaGW-rtTA&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#19780&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-EGFP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84041</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-MCS</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84008</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">FUW-tetO-wtYAP</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84009</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:481px;">FUW-tetO-YAPS94A</td>
			<td style="width:123px;">Addgene</td>
			<td style="width:112px;">&#160;#84010</td>
			<td style="width:384px;">used as negative control (transcriptionally dead YAP mutant)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMax</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">35050061</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">24020117</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heparin sodium salt</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">H3149&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution (1M)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">15630-056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human R-Spondin1 (His Tag)</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>11083-H08H-5</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase from bovine testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ITS-X</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab7800&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">K-8 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td>Ab14053&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:112px;">&#160;25030081</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lin (allophycocyanin [APC] mouse lineage antibody cocktail)</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">51-9003632</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel&#174; Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>0402</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72340</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">non-cell adhesive 10 cm dishes (sterile polystirol petri dish &#248; 94)</td>
			<td style="width:123px;">ROLL</td>
			<td style="width:112px;">18248</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 10x</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECM4004XL</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE Hamster Anti-Mouse CD61</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">553347</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE-Cy5 Rat Anti-Human CD49f</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">551129</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse/rat CD29 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">BioLegend</td>
			<td style="width:112px;">102222</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen/Strep (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I (coating)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:112px;">122-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen I for 3D culture</td>
			<td>Cultrex</td>
			<td>3447-020-01&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant human Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">recombinant murine FGF basic (bFGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td style="width:112px;">450-33</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31870025</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SBTI (Trypsin inhibitor from Glycine max)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522&#160;</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris BASE&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814273001</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA 0,05%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waymouth medium</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>31220023</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

de novo generation of somatic stem cells by yap/taz

Qui presentiamo protocolli per isolare cellule differenziate primarie e girare che li in cellule staminali/progenitrici (SCs) della stessa stirpe di espressione transitoria del fattore di trascrizione YAP. Con questo metodo, Luminale cellule differenziate di (LD) della ghiandola mammaria del mouse vengono convertite in cellule che esibiscono proprietà molecolari e funzionali di mammaria SCs. YAP inoltre si trasforma completamente differenziato pancreatica esocrina cellule nel pancreas condotto-come progenitori. Allo stesso modo, al SCs endogeno, naturale, YAP-indotta di cellule staminali-simili ("ySCs") possono essere alla fine ampliate come organoid colture a lungo termine in vitro, senza ulteriore bisogno di ectopico YAP/TAZ, come ySCs sono dotati di uno stato ereditabile autorinnovabile SC.
La procedura di riprogrammazione qui presentata offre la possibilità di generare ed espandere in vitro cellule progenitrici delle varie fonti di tessuto a partire da cellule differenziate. La semplice espansione di cellule somatiche ex vivo ha implicazioni per la medicina rigenerativa, per comprendere i meccanismi dell'inizio del tumore e, più in generale, per cellulare e gli studi di biologia dello sviluppo.

Generazione di yMaSCs Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare cellule mammarie a LD primarie di espressione transiente di YAP è presentata in Figura 1A. Cellule epiteliali mammarie primarie di LD sono purificate da fluorescente-attivata cella ordinamento13. Figura 1B rappresenta una tipica procedura di ordinamento per ottenere tre distinte sottopopolazioni: cellule basali (EpCAMbassoCD49faltaCD61–), le cellule progenitrici Luminal (LP) (EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ ) e le cellule LD (EpCAMaltaCD49fbassoCD61–). Attenzione gating di tre sottopopolazioni è indispensabile per isolare una preparazione pura di cellule di LD, che sono completamente differenziate e completamente crescita arrestato quando seminati in condizioni (Vedi Figura 1, pannello sinistro) di formazione di colonie di ghiandola mammaria. Al contrario, quando indotte per esprimere esogeno YAP, LD cellule iniziano a proliferare per formare colonie epiteliali densi facilmente riconoscibile in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato di 5% (Figura 1). L'efficienza della riprogrammazione, attestata intorno al 3% per un tipico esperimento, possono essere segnati contando il numero di colonie sopra il numero di singole cellule originariamente seminati in colture in sospensione matrice della membrana dello scantinato (Figura 1). Cellule riprogrammate luminale (yMaSCs) possono essere quindi il passaggio in 100% della membrana dello scantinato matrice organoid condizioni di coltura (Vedi schema in Figura 1A), auto-organizzazione in complesse organoid-come le strutture che si sviluppano attorno più lumen e visualizzare la capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (cioè in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 1E). Istologicamente, yMaSC-derivati organoids visualizzare uno strato basale (K14 positivo), affrontando la matrice della membrana basale ricostituita ECM e uno strato di luminal (K8 positivo), affrontando le cavità lumen-come all'interno di organoid (Figura 1F). Questa architettura è indistinguibile da quella dei organoids formata da popolazione nativa (Figura 1F).
Generazione di yDucts Una panoramica della strategia sperimentale per riprogrammare i acini pancreatici primari di espressione transiente di YAP è presentata nella Figura 2A. Interi gruppi acinose sono isolati dalla massa del tessuto pancreatico tramite una combinazione di lieve dissociazione e l'esclusione di dimensione attraverso la filtrazione. Una preparazione tipica è presentata nella Figura 2B. Dopo l'isolamento, i cluster di cellule acinose dovrebbero apparire come una sospensione di esocrino acinose unità di dimensioni omogenee, senza contaminazione di endocrino isolotti di Langerhans o frammenti del albero duttale pancreatico e minima dissociazione di singole cellule. Contaminazione da isolotti endocrini o frammenti ductal è un'indicazione di filtrazione selettiva carenti (passo 2.1.10), probabilmente a causa di manipolazione duro; dissociazione indesiderati di acinose cluster da singole cellule potrebbe essere dovuto trattamento eccessivo collagenasi o unbuffered attività degli enzimi proteolitici rilasciato dal tessuto, che può essere frenato dal trattamento SBTI supplementare.
Un tipico esperimento di riprogrammazione acinoso è presentato in Figura 2; entro 5-7 giorni di cultura in collagene 3D-ho basato idrogel in presenza di doxiciclina, acini pancreatici derivati da topi R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A facilmente trasformano in condotto-come cluster (che abbiamo chiamato yDucts), composto da un sottile monostrato di cellule epiteliali che proliferano intorno a una cavità centrale in espansione. L'efficienza di riprogrammazione, che è circa il 70% per un tipico esperimento, può essere facilmente misurato segnando il numero di cluster condotto-come oltre il numero totale di teste di serie dei acini (Figura 2D). Il controllo negativo cellule, cioè R26-rtTAM2 / + cellule o R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A celle a sinistra senza doxiciclina, invariabilmente rimangono come post-mitotici acinose cluster in queste condizioni di coltura, come precedentemente segnalate1 ,14,15. Riprogrammate yDucts può quindi essere attraversate a livello di singola cellula in basati su Matrigel organoid cultura condizioni16 (Vedi schema in Figura 2A), visualizzazione di capacità di auto-rinnovamento notevole anche in assenza di doxiciclina (vale a dire in assenza di espressione di YAP transgenici) (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figura 1: Cellule staminali: cellule isolamento di LD mammario primario e l'induzione di mammaria. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule mammarie primarie di LD. (B) rappresentante FACS-piazzole che illustra una tipica procedura di ordinamento per purificare le cellule LD. i) dissociate cellule sono gated secondo scatter avanti e laterali per cellule vive (P1; blu); II) popolazione P1 è poi ulteriormente recintata in base al relativo profilo di Lin: la sottopopolazione delle cellule Lineage-negative (P2; grigio) è selezionata, escluse le cellule ematopoietiche Lineage-positive; III) popolazione P2 viene poi separata in un EpCAMalta (P3; giallo + verde) e unbasso (P6; rosso) sottopopolazioni di EpCAM; IV) P3 e P6 sono quindi ulteriormente gated secondo il loro profilo di CD61/CD49f in tre sottopopolazioni: EpCAMbassoCD49faltaCD61 cellule basali– (P7; rosso), EpCAMaltaCD49fbassoCD61+ LP cellule (P8; giallo) ed EpCAMaltaCD49fbassoCD61 cellule di LD– (P9; verde). (C) immagini sono illustrative della capacità delle cellule di LD, infettati con i costrutti indicati, di formare colonie mammarie 15 giorni dopo la semina in mezzo Colonia mammaria. Solo YAP-esprimendo le cellule diventano formanti colonie cellule, considerando che cellule di controllo negativo (EGFP-infettati) rimangono come celluli crescita-arrestato. Barra della scala = 50 μm. (D) quantificazione della Colonia formando la capacità delle cellule indicate, come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, ciascuno con sei repliche tecniche. (E) immagine rappresentativa di YAP-riprogrammato cellule staminali-come delle cellule mammarie (yMaSCs) dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Scala bar = 100 μm. (F) immagini di immunofluorescenza rappresentativo per il marcatore basale K14 (verde) e l'indicatore di luminal K8 (rosso) dei organoids derivano dalle cellule indicate, dopo 12 giorni in condizioni di coltura organoid. Barra della scala = 10 μm. Questa figura è riprodotto da Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figura 2 : Isolamento delle cellule acinose pancreatiche primarie e l'induzione dei progenitori del pancreas. (A) rappresentazione schematica delle procedure sperimentali adottate per riprogrammare le cellule acinose esocrine pancreatiche primarie. (B) immagine rappresentativa dei acini pancreatici primari subito dopo la procedura di isolamento (passo 2.1.14). La preparazione acinosa dovrebbe apparire come una sospensione omogenea di cluster acinose, con minima presenza di singole cellule. Barra della scala = 400 μm. (C) immagini rappresentative dei acini pancreatici primari derivata da R26-rtTAM2 (pannelli superiori)o R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (inferiore pannelli) topi e coltivate in 3-d collagene I-base di idrogel per 5 giorni con o senza Doxiciclina (doxy), come indicato. YAP-esprimendo i acini primari convertire solo in cellule che crescono come ciste-come organoid dopo aggiunta di doxiciclina. Scala bar = 70 μm. (D) quantificazione della capacità dei acini pancreatici per formare ductal organoids su transgenici YAP sovraespressione come in (C). I dati sono presentati come media + s.d. e sono rappresentativi di cinque esperimenti indipendenti, eseguita con quattro ripetizioni di tecniche. (E) immagine rappresentativa YAP-riprogrammata ductal-come delle cellule (yDucts) dopo tre passaggi in fresco idrogel dei matrice tridimensionale 100% della membrana dello scantinato in assenza di doxiciclina. Barra della scala = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento delle cellule mammarie primarie</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + soluzione di chelatazione</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0,02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagene sono soluzione di rivestimento</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acido acetico 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagene di coda di ratto (rivestimento)</td>
			<td>01:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di dispase</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio di dissociazione</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di riserva di ialuronidasi</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emolitica soluzione</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di NH4Cl</td>
			<td>1 parti</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 parti</td>
		</tr>
<tr>
<td>aggiustare il pH a 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di riserva di ialuronidasi</td>
			<td>Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ialuronidasi dai testicoli bovini (polvere)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampone fosfato di sodio 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Soluzione di NH4Cl</td>
			<td>Conservare a T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>regolare il pH a 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>L'ordinamento di soluzione</td>
			<td>Filtro 0,2 µm, conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavare mezzo #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavare medio #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Terreno di coltura 2D mammaria</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutammina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Induzione e Passaging di yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammari Colonia Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-Glutammina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (aggiungere immediatamente prima della semina)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Mammari Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avanzata</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>eparina</td>
			<td>4 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murina bEGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: generazione di yMaSCs. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento delle cellule mammarie primarie di LD e induzione di yMaSCs (sezione 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Isolamento dei acini pancreatici primari</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Terreno di coltura acinose</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desametasone</td>
			<td>1 µ g/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ITS-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium di Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinose lavaggio medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0,1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medium RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acinose recupero medio</td>
		</tr>
<tr>
<td>Terreno di coltura acinose</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenasi ho soluzione A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acinose lavaggio medio</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Conservare a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>Conservare a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi, tipo io (polvere)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Passaggio dei organoids del pancreas</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Collagenasi ho soluzione B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenasi di soluzione madre ho</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pancreatico Organoid Medium</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanzata DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrina</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin umano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>murino EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetilcisteina</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinammide</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: generazione di yDucts. Composizione di tutti i diversi terreni di coltura e soluzioni necessarie per l'isolamento di cellule acinose primarie e induzione e passaggio di yDucts (sezione 2).

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De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Disponibilità di SCs somatiche è fondamentale per la medicina rigenerativa, modellazione di malattia e per ottenere informazioni sulle proprietà di SC. Qui presentiamo strategie sperimentali per riprogrammare, in vitro, differenziato cellule adulte nelle loro cellule tessuto-specifici espandibile staminali/progenitrici corrispondente dall'espressione transitoria co-dell'attivatore trascrizionale unico YAP.

De Novo Generazione di cellule staminali somatiche da YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

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Research

JoVE Journal

Biology

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

8.9K Views.  University of Padua School of Medicine. Disponibilità di SCs somatiche è fondamentale per la medicina rigenerativa, modellazione di malattia e per ottenere informazioni sulle proprietà di SC. Qui presentiamo strategie sperimentali per riprogrammare, in vitro, differenziato cellule adulte nelle loro cellule tessuto-specifici espandibile staminali/progenitrici corrispondente dall'espressione transitoria co-dell'attivatore trascrizionale unico YAP.

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Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the differentiation of ES cells is the formation of embryoid bodies (EBs) aggregates 2, 3. EB formation is based on spontaneous aggregation when ES cells are cultured in non adherent plates. Three-dimensional EB recapitulates many aspects of early mammalian embryogenesis and differentiate into the three germ layers: ectoderm, mesoderm and endoderm 4.
Immunofluorescence and in situ hybridization are widely used techniques for the detection of target proteins and mRNA present in cells of a tissue section 5, 6, 7. Here we present a simple technique to generate high quality cryosections of embryoid bodies. This approach relies on the spatial orientation of EB embedding in OCT followed by the cryosection technique. The resulting sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to characterize populations of cells containing certain proteins, RNA or DNA. In this sense, the preparation of EB cryosections (10&mu;m) are essential tools for histology staining analysis (e.g. Hematoxilin and Eosin, DAPI), immunofluorescence (e.g. Oct4, nestin) or in situ hybridization. This technique can also help to understand aspects of embryogenesis with regards to the maintenance of the tri-dimensional spherical structure of EBs.

Pluripotent stem cells growing in suspension differentiate into embryoid bodies (EBs). Here we demonstrate how to obtain high quality EB cryosections useful for studying cellular and molecular aspects of embryogenesis, while preserving their organization as aggregates.

Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells derived from the inner cell mass of blastocyst-stage early mammalian embryos 1. A crucial stage in the ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

Proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Progettazione di biomolecole

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo inseguimento 4-dimensionale di emopoietiche staminali e progenitrici celle di topo adulto cranica di Midollo Osseo

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.