Questo studio è completamente supportato dalla divisione di ricerca intramurale dell'Istituto nazionale di ricerca infermieristica del NIH, Bethesda, Maryland.

Lo studio corrente (NCT00852111) è stato approvato da Institutional Review Board (IRB) di istituti nazionali di salute (NIH), Bethesda, Maryland. I partecipanti arruolati in questo studio erano uomini euthymic, 18 anni di età o più anziani, che sono state diagnosticate con cancro alla prostata non-metastatico con o senza prostatectomia priore e sono stati programmati per ricevere la radioterapia esterna del fascio (EBRT). Potenziali partecipanti sono stati esclusi se avevano una malattia progressiva che potrebbe causare notevole affaticamento, hanno avuti malattia psichiatrica negli ultimi cinque anni, ha avuto non riveduta ipotiroidismo o anemia, o ha avuto una seconda malignità. Gli individui che sedativi, steroidi o agenti anti-infiammatori non steroidei utilizzati anche sono stati esclusi. I campioni di sangue di controllo in buona salute sono stati ottenuti presso la medicina NIH dipartimento di trasfusione da donatori sani sotto un protocollo approvato IRB (NCT00001846). Tutti i partecipanti sono reclutati al Magnuson Clinical Research Center al NIH. Prima della partecipazione allo studio sono stati ottenuti consensi scritti firmati.
1. mitocondriale funzione misurazione preparazione (giorno 1 dell'esperimento)
<ol><li>Idratare la cartuccia sensore (Vedi Tabella materiali; durata approssimativa: 5 min).<ol>
<li>Rimuovere la cartuccia sensore dal pacchetto. Aggiungere 200 μL di soluzione di calibratore in ciascun pozzetto della piastra utilità, quindi riempire ogni fossato con 400 μL di soluzione di calibratore.</li>
		<li>Piatto di sensore ritorno alla piastra di utilità, che ora ha calibratore soluzione in esso. Idratare la cartuccia in un incubatore a 37 ° C non-CO2 durante la notte. Nota: Cartuccia sensore deve essere idratata per un minimo di 4 ore e un massimo di 72 ore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione del campione clinica (giorno 2 dell'esperimento)
<ol><li>Affaticamento di misura utilizzando il 13-elemento funzionale valutazione di malattia la terapia cronica - affaticamento (FACIT-F)2,23,24 al basale (prima di iniziare la radioterapia esterna), punto medio e completamento della radioterapia esterna e 1 anno post-radioterapia esterna.<ol>
<li>Utilizzare un 0 - 4 scala per ogni elemento risposta, dove 0 rappresenta "non è affatto" e un 4 indica che il convenuto si riferisce all'istruzione del corrispondente "molto." Punteggi totali dovrebbero variare da 16-53, con punteggi più bassi che riflette intensità alte di affaticamento.</li>
		<li>Definire fatica come un punteggio FACIT-F inferiore a 43, con un punteggio di FACIT-F di ≥43 che indica assenza di o non clinicamente significativo affaticamento2. Nota: Un punteggio FACIT-F di 43 migliori divide fatica decine di malati di cancro e la popolazione generale2.</li>
		<li>Includono i seguenti 13 elementi della scala di affaticamento FACIT: 1) mi sento affaticato; 2) mi sento debole tutto; 3) mi sento svogliata ("lavato fuori"); 4) mi sento stanco; 5) ho problemi con l'avvio di cose perché sono stanco; 6) ho difficoltà a finire le cose perché sono stanco; 7) ho energia; 8) sono in grado di fare le mie solite attività; 9) ho bisogno di dormire durante il giorno; 10) sono troppo stanco per mangiare; 11) ho bisogno di aiuto facendo la mia solita attività; 12) sono frustrato di essere troppo stanchi per fare le cose che voglio fare; e 13) devo limitare la mia attività sociali perché sono stanco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolare i PBMC dai campioni di sangue appena prelevato (durata approssimativa: 1 h).<ol>
<li>Raccogliere 8 mL di sangue in una provetta di preparazione di cellule mononucleari (Vedi Tabella materiali). Nota: I campioni di sangue devono essere elaborati entro 2 h dalla raccolta. La qualità di PBMCs può essere compromessa se i campioni di sangue vengono elaborati più di 2 ore dal prelievo.</li>
		<li>Centrifugare a 1.750 x g per 30 min a temperatura ambiente (18-25 ° C). Trasferire lo strato nuvoloso per un tubo conico da 15 mL. Aggiungere fino a 15 mL di PBS e capovolgere 5 volte.</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere con cautela e scartare il supernatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con l'aggiunta di fino a 10 mL di PBS e capovolgere 5 volte.</li>
		<li>Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il liquido surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS. Trasferire i PBMCs in una provetta di microfuge 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugare a 610 x g per 10 minuti. Con attenzione rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in completo RPMI-1640 (RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 10mm penicillina/streptomicina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cappotto cella piastre per cellule non aderenti (durata approssimativa: 30 min).<ol>
<li>Preparare la soluzione di adesivo di cellule e tessuti (Vedi Tabella materiali) diluendo la soluzione di riserva in bicarbonato di sodio 0,1 M a pH 8.0. La soluzione di lavoro dovrebbe essere a 3,5 µ g/cm2 di superficie. Nota: Questa soluzione contiene polifenolici proteine estratte dal mitilo marino, Mytilus edulis. Queste proteine sono componenti chiave della colla secernuta dalla cozza per ancorarsi alle superfici. Troviamo che la cella-Tak funziona meglio con PBMCs.</li>
		<li>Aggiungere 100 μL della soluzione adesiva diluita in ciascun pozzetto e incubare per almeno 20 min a temperatura ambiente. Lavare tre volte con acqua deionizzata e aria secca.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mitocondriale funzione misurazione
<ol><li>Preparazione di analisi Media (durata approssimativa: 10 min). Nota: La media di analisi dovrà essere preparate il giorno dell'esperimento.<ol>
<li>Aggiungere L-glutamina, piruvato e glucosio alla base media (i costituenti stessi come per volta Eagle di Dulbecco Medium (DMEM), ma senza bicarbonato di sodio, glucosio, glutamina o sodio piruvato) per realizzare un supporto di analisi. Riscaldare la media di 37 ° C, quindi regolare il pH a 7,4. Nota: Le concentrazioni di L-Glutammina, piruvato ed il glucosio sono solitamente le stesse concentrazioni nei media di crescita normale, ma possono essere regolate in base il dosaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs di preparare per il test di Stress di Mito (durata approssimativa: 2 h).<ol>
<li>In ogni pozzetto per raggiungere confluency di 80-90% del piatto abbastanza PBMCs dal passaggio 2. Nella nostra esperienza, 1.5 x 105 cellule/pozzetto ha prodotto i risultati più coerenti. Nota: Wells A e H sono pozzi di sfondo e deve contenere solo analisi media con nessuna cellula. In pozzi da B a G, si consiglia di almeno 3-6 pozzetti per paziente campione di placcatura per tenere conto di valori anomali.</li>
		<li>Rallentare piastre a 200 x g per 2 minuti per permettere che le cellule di aderire al fondo dei pozzetti. Lavare le cellule una volta con media di dosaggio. Questo passaggio rimuove il bicarbonato di sodio e del siero dal supporto di crescita. Nota: Nella nostra esperienza, la fase di lavaggio rimuove in genere 20-30% delle cellule.</li>
		<li>Aggiungi media di dosaggio 180 μL in ogni pozzetto, tra cui sfondo pozzi A e H. Incubare in un incubatore a 37 ° C non-CO2 per 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esecuzione del Test di Stress di Mito<ol>
<li>Ricostituire i farmaci nel Mito Stress Kit con media di test come segue:<ol>
<li>Oligomycin: Aggiungi 252 μL analisi media nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Aggiungere 288 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / Rotenone: aggiungere 216 μL di media di dosaggio nel flaconcino per generare una soluzione di riserva a 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortice ricostituito farmaci per circa 1 minuto. Diluire in soluzioni di lavoro. Nota: Le concentrazioni delle soluzioni di lavoro dovrebbero essere titolate e pre-determinate prima dell'esperimento a seconda del tipo di cella. Per PBMCs, troviamo quel 1 μM di Oligomycin, 1 μM FCCP e 0,5 μM antimycin A / Rotenone funzionare al meglio.</li>
		<li>Dispensare i farmaci in ogni porta nella cartuccia sensore in sequenza:<ol>
<li>R: Porta pipetta 20 μL 10 μm Oligomycin, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.</li>
			<li>Porta b: pipetta 22 μL 10 μm FCCP, per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 1 μM.</li>
			<li>C: Porta pipetta 25 μL di 5 μM antimycin A / rotenone per una concentrazione finale in ciascun pozzetto di 0,5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selezionare "Test di Stress di Mito" su uno strumento di cambiamento continuo extracellulare. Seguire il prompt dei comandi dello strumento e inserire la cartuccia sensore. Lo strumento eseguirà automaticamente la calibrazione del sensore. Inserire la piastra di cella dopo calibrazione del sensore e lo strumento si concluderà il resto del saggio. Dinamica dell'ossigeno è misurata a 530 nm (eccitazione) / 650nm (emissione), e concentrazione di protoni viene misurata a 470 nm (eccitazione) / 530 nm (emissione).</li>
</ol>4. normalizzazione dei dati la funzione mitocondriale
<ol><li>Preparare la soluzione di saggio di proliferazione cellulare (durata approssimativa: 5 min).<ol>
<li>Aggiungere 48 μL acido nucleico macchia (500 x) e soppressore di sfondo 240 µ l a 11,7 mL di PBS (2x). La macchia di acido nucleico è un colorante di legame al DNA cellulare-permeante e il soppressore di sfondo è un colorante di mascheramento che blocca le cellule morte o cellule con l'integrità della membrana cellulare compromessa da essere macchiato. La combinazione del colorante DNA-legantesi e il soppressore di sfondo assicura che solo dal vivo cellule sono macchiate.</li>
		<li>Una volta completata la prova di sforzo di Mito, aggiungere uguale volume di soluzione di lavoro (180 μL): 2x direttamente nel mezzo in ciascun pozzetto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare le cellule in presenza di soluzione di saggio di proliferazione delle cellule in un incubatore a 37 ° C per 45-60 min. quantificare il numero di cellule vive (fluorescenti) su un lettore alla 508 nm (eccitazione) / 527 nm (emissione) e normalizzare i dati OCR (durata approssimativa: 10 min) . Nota: oltre a numero cellule vive, gli utenti possono anche scegliere normalizzare i dati con il numero totale delle cellule, la quantità di acido nucleico, concentrazioni di proteine, ecc.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Affaticamento in malati di cancro è una condizione debilitante che non è ben definito o caratterizzato1. Diagnosi di affaticamento si basa interamente su una relazione soggettiva e non c'è nessuna corrente standard diagnostico o trattamento per questa circostanza, in gran parte a causa di una mancanza di comprensione nella sua pathobiology2. Dei meccanismi proposti affaticamento nei pazienti oncologici, danno nella funzione mitocondriale è una delle vie più terapeutica...

La fatica è una condizione prevalente e angosciante che ha un impatto negativo sulla qualità della vita dei pazienti di cancro1. A questa data, la fatica di cancro rimane definita male e si basa solo su segnalazione soggettiva da pazienti2. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di identificare un test di laboratorio diagnostico facilmente adattabile per caratterizzare obiettivamente fatica in ambiente clinico3,4.
I meccanismi sottostanti multipli, compreso disfunzione di mitocondri, sono state proposte per causare affaticamento5. I mitocondri sono gli organelli di centrale elettrica, fornendo il 95% del fabbisogno energetico cellulare tramite fosforilazione ossidativa e svolgono un ruolo importante nella segnalazione del calcio, apoptosi, segnalazione immuni e regolamento di altri di eventi di segnalazione intracellulare6 . Di conseguenza, bioenergetica mitocondriale alterata e difetti nella produzione di energia possono contribuire alla fatica. Supporto di questa ipotesi, gli studi precedenti hanno osservato le mutazioni nel DNA mitocondriale in pazienti con la sindrome di stanchezza cronica7. Mentre rimane poco chiaro se l'origine patofisiologica della fatica si trova all'interno del sistema nervoso centrale o i tessuti periferici, come i muscoli scheletrici8,9, attualmente non esiste un metodo diretto per valutare con precisione disfunzione mitocondriale legata alla stanchezza in live, contenenti cellule.
Usando cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) per studiare la funzione mitocondriale offre diversi vantaggi. In primo luogo, PBMC sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando flebotomia standard e possono essere isolati rapidamente utilizzando tecniche di laboratorio di base. In secondo luogo, la raccolta del sangue è meno dilagante che raccogliendo altri tessuti quali una biopsia del muscolo. Così, i campioni di sangue possono essere raccolti dallo stesso paziente ripetutamente nel corso del tempo, che facilita la valutazione longitudinale degli effetti del trattamento. Interessante, la funzione mitocondriale in PBMCs ha sembrato essere ben correlato con Rene stato mitocondriale in un modello animale10. Inoltre, i mitocondri delle cellule immuni sono stati utilizzati come proxy per la rilevazione di cambiamenti sistemici sotto condizioni differenti di malattia11,12. I mitocondri in cellule immuni circolanti sono particolarmente sensibile ai cambiamenti nelle funzioni immuni e immuni segnalando le molecole quali le citochine13,14,15. Ad esempio, si è osservato che PBMCs da pazienti con malattie infiammatorie reumatiche acute presentano basale elevato consumo dell'ossigeno,14. Al contrario, il consumo di ossigeno è stato ridotto in PBMC isolati dai pazienti con le circostanze infiammatorie sistemiche comprese sepsi16. Nelle circostanze infiammatorie, radicali liberi prodotti dai mitocondri disfunzionali possono contribuire ulteriormente ad elevati stress ossidativo e infiammazione prolungata17. Il ruolo centrale dei mitocondri nella produzione di energia anche come stress ossidativo suggerisce l'utilità potenziale di usando la funzione mitocondriale come un proxy per lo studio della fatica in cancro pazienti 13.
Precedenti studi hanno esaminato la funzione mitocondriale utilizzate tecniche biochimiche, misura del potenziale di membrana mitocondriale o l'isolamento di popolazioni di cellule specifiche che non possono essere facilmente adattabile nella regolazione clinica5, 14,18. Negli ultimi anni, lo sviluppo di analisi di flusso extracellulare ha permesso ai ricercatori di facilmente e accuratamente esaminare i cambiamenti nel tasso di consumo di ossigeno (OCR) in risposta alle iniezioni automatizzate di inibitori respiratori19,20 , 21 , 22. Tuttavia, la maggior parte di questi studi sono progettata per tipi cellulari specifici e il grande formato di alto-rendimento potrebbe non essere applicabile in una regolazione clinica. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo ottimizzato per esaminare la funzione mitocondriale per uso clinico.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

L'affaticamento è un comune e debilitante che colpisce la maggior parte dei malati di cancro. Fin qui, resti di affaticamento scarsamente caratterizzati con nessuna diagnostica di test per misurare obiettivamente la gravità di questa condizione. Qui descriviamo un metodo ottimizzato per la valutazione della funzione mitocondriale di PBMCs raccolti dai malati di cancro affaticato. Usando un sistema compatto flux extracellulare e iniezione sequenziale di inibitori respiratori, abbiamo esaminato lo stato funzionale mitocondriale di PBMC misurando la respirazione mitocondriale basale, ricambio capacità respiratoria ed il fenotipo di energia, che descrive la via di energia preferita di rispondere allo stress. PBMCs fresco sono prontamente disponibili in ambito clinico utilizzando standard flebotomia. L'intera analisi descritto nel presente protocollo può essere completato in meno di 4 ore senza il coinvolgimento di tecniche biochimiche complesse. Inoltre, descriviamo un metodo di normalizzazione che è necessario per ottenere dati riproducibili. La semplice procedura e normalizzazione metodi presentati consentono per raccolta di campioni ripetuti dallo stesso paziente e generazione di dati riproducibili che possono essere confrontati tra intervalli di tempo per valutare i potenziali effetti del trattamento.

Il Test di Stress di Mito si basa sul tasso di consumo di ossigeno (OCR) di misura dopo iniezione sequenziale di vari inibitori respiratori per mappare un profilo mitocondriale completo. Misurazioni di OCR dopo ogni iniezione di droga può essere utilizzato per calcolare i seguenti parametri relativi alla salute mitocondriale: OCR basale prima viene misurata prima di ogni iniezione di droga per valutare il consumo di ossigeno necessario per soddisfare la domanda di livell...

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Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Views.  National Institutes of Health. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un protocollo pratico per valutare la disfunzione mitocondriale è associata con affaticamento nei pazienti oncologici. Questo innovativo protocollo è ottimizzato per uso clinico che coinvolge phlebotomy solo standard e procedure di laboratorio di base.

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Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Il tapis roulant fatica di prova: un test semplice, high-throughput di stanchezza simile comportamento per il mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Comportamento

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Generazione di cibridi trasmettitocondriali da cellule tumorali in sospensione

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autore in primo piano: Generazione di cibridi trasmissocondriali utilizzando linee cellulari tumorali  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Biochimica

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Medicina

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Immunologia e infezioni

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

<meta charset="utf8"></head><body>Uso di metodi minimamente invasivi per valutare l'utilizzo del carburante e i ritmi circadiani negli anziani

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Uso di metodi minimamente invasivi per valutare l'utilizzo del carburante e i ritmi circadiani negli anziani

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Valutare il ruolo della funzione mitocondriale in affaticamento legato al cancro

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

Il tapis roulant fatica di prova: un test semplice, high-throughput di stanchezza simile comportamento per il mouse

Determinazione analitica della funzione mitocondriale degli omogeneizzati tumorali solidi asportati

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

Valutazione della funzione mitocondriale nel nervo sciatico mediante respirometria ad alta risoluzione

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

Uso di metodi minimamente invasivi per valutare l'utilizzo del carburante e i ritmi circadiani negli anziani