This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1 Totale Pigmento Estrazione da foglie di spinaci <ol><li> Omogeneizzare una manciata di foglie di spinaci (~ 20 g) in 100 ml di freddo Grinding Buffer (vedi Tabella 1) con un frullatore per 20 sec. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso due strati di tessuto di nylon con un diametro dei pori di 20 micron e centrifugare il filtrato a 1.500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet contenente i cloroplasti con un morbido artisti pennello di vernice in 1 ml di tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1). Una volta che il pellet viene risospeso, aggiungere 50 ml di tampone di lavaggio e centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet (tilacoidi) in 50 ml di tampone di lavaggio (vedi Tabella 1). </li><li> Centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e rimuovere completamente il surnatante. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l&#39;ossidazione del pigmento. </li&gt; <li> Aggiungi ~ 20 ml di acetone 80% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi tabella 1) per estrarre i pigmenti. Lasciare la soluzione in ghiaccio per 10 minuti, vortex di tanto in tanto. </li><li> Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 1.6 deve essere ripetuto. </li><li> Raccogliere il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere 0,4 volumi di dietiletere, agitare vigorosamente e aprire la valvola di sfogo del gas. </li><li> Aggiungere 0,8 volumi di 0,33 M NaCl e mescolare energicamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea sopra contiene i pigmenti estratti. Rimuovere la fase inferiore chiara. NOTA: Se la separazione non è chiara, congelare e scongelare la soluzione per migliorare la separazione di fase. </li><li> Rimuovere l&#39;etere versandolo dall&#39;alto della imbuto separatore in un contenitore di vetro adatto. Secco con l&#39;aggiunta di un cucchiaio di granlare solfato di sodio anidro. Agitare la soluzione e lasciare ~ 5 min per l&#39;essiccante per assorbire l&#39;acqua dall&#39;etere. NOTA: Ripetere questo passaggio se il solfato di sodio appare completamente raggruppata insieme; ci dovrebbero essere alcuni cristalli liberi di fluttuare quando l&#39;etere è sufficientemente asciugato. Se si forma un velo d&#39;acqua, rimuovere questo con una pipetta Pasteur prima di aggiungere ulteriore solfato di sodio anidro. </li><li> Decantare l&#39;etere di un nuovo contenitore di vetro, lasciando il solfato di sodio solido dietro. </li><li> Si evapora l&#39;etere in un speedvac rotativo o sotto flusso di N 2. </li><li> Sciogliere i pigmenti completamente in 10 ml di acetone 100%. </li><li> Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento e determinare l&#39;a / b rapporto Chl e la concentrazione di Chl con il metodo descritto da Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquota e asciugare i pigmenti in una speedvac rotativo o sotto N 2 fino a quando il flusso di acetone ècompletamente evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. </li></ol> 2 Estrazione di carotenoidi da spinaci <ol><li> Seguire i passaggi da 1.1 a 1.5. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l&#39;ossidazione del pigmento. </li><li> Risospendere il pellet tilacoidi in ~ 50 ml di etanolo al 96% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi Tabella 1) per estrarre i pigmenti. La soluzione viene lasciata in ghiaccio per 5 min. </li><li> Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 2.2 deve essere ripetuto. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere 0,1 volume del 80% KOH (w / v) per avviare saponificazione. </li><li> Lasciare la soluzione a 4 ° CO / N, ben chiuso e al riparo dalla luce. </li><li> Raccogliere la soluzione in un imbuto separatore. Aggiungere 1 volume di etere etilico e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 0,8 volUmes di 0,33 M NaCl e mescolare delicatamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea arancione sulla parte superiore contiene i carotenoidi saponificati. Rimuovere la fase inferiore verde drenando attraverso il rubinetto dell&#39;imbuto. </li><li> Aggiungere 3 volumi di acqua e mescolare delicatamente per rimuovere l&#39;idrossido di potassio. Lasciare che gli strati si separino. NOTA: Se la fase superiore appare torbido, aggiungere una piccola quantità di NaCl (ad esempio, 3 g di NaCl in 200 ml di soluzione) e miscelare delicatamente per sciogliere. </li><li> Rimuovere la fase inferiore di drenaggio attraverso il rubinetto dell&#39;imbuto. </li><li> Seguire i passaggi da 1,10-1,13. </li><li> Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento a 440 nm nel 80% acetone. Per determinare la concentrazione, utilizzare l&#39;estinzione media coefficiente per i carotenoidi (ε 440 = 255) 16 nel seguente formula: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (cammino ottico) = 1 cm. </li><li> Aliquota e asciugare il carotenoids in un speedvac o sotto N 2 torrente fino a quando tutti etere etilico è stato evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. </li></ol> 3 Totale pigmento e carotenoide Estrazione da Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Grow C. reinhardtii su terreno solido TAP 17 in una capsula di Petri diffondendo una piccola quantità di coltura liquido sulla superficie. Crescere sotto illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1 fino a uno strato verde di cellule è visibile. </li><li> Utilizzando un&#39;ansa da inoculo sterile, raccogliere una piccola quantità di C. reinhardtii dal mezzo TAP solida e mettere le cellule in 500 ml di TAP media 17 in un pallone da 1 L. Far crescere la coltura a 25 ° C con 170 giri al minuto, agitando sotto un&#39;illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1. </li><li> Dopo 5-6 giorni, la cultura dovrebbe raggiungere la fine della fase logaritmica (6 x 10 6 cellule / mlo 2-2,5 densità ottica a 750 nm). Centrifugare la cultura a 4.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Per l&#39;estrazione totale del pigmento, seguire i passaggi 1,6-1,15. </li><li> La resa di estratto totale pigmento a partire da 500 ml di coltura piena crescita di C. reinhardtii è di circa 5 ml di soluzione con una concentrazione di 0,5 mg Chl a + b / ml. </li><li> Per l&#39;estrazione carotenoidi, seguire i passaggi 2,2-2,12. </li></ol> 4 Purificazione di corpi di inclusione <ol><li> Clonare la sequenza codificante della proteina LHC di interesse in un vettore di espressione che si traduce in un C-terminale sua tag fuso utilizzando le procedure di biologia molecolare standard. Trasforma questo costrutto in E. ceppo ospite coli come BL21 (DE3). </li><li> Preparare il tampone di lisi, tampone detergente, buffer di Triton, TE (Tabella 1), 1 M isopropilici β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e terreno LB 18 con gli antibiotici appropriati. </li><li> Scegli una single E. coli colonia contenente il clone di espressione da un piatto appena striato in ~ 5 ml di terreno LB con gli antibiotici appropriati utilizzando le procedure standard 6. Crescere a 37 ° C con 220 rpm agitazione per almeno 16 ore. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di O / N cultura in un pallone da 1 L Erlenmeyer con 250 ml di LB integrate con l&#39;antibiotico appropriato. </li><li> Crescere le cellule per 2-3 ore (o fino a quando l&#39;OD 600 è ~ 0.6) a 37 ° C a 220 giri al minuto. </li><li> Aggiungi IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Continua a crescere le cellule a 37 ° C con 220 giri 3-4 ore. </li><li> Centrifugare la coltura per 10 min a 5000 xga 4 ° C in una provetta da centrifuga pre-pesato. Eliminare il supernatante a fondo e determinare il peso del pellet pesando di nuovo e sottraendo il peso provetta da centrifuga. </li><li> Risospendere il E. pellet di cellule coli in 0,8 ml / g di tampone di lisi nel vortex vigorosa. NOTA: In alternativa, il pellet cellulare può essere congelato a -80C per un uso successivo. Se a partire da un pellet congelato, lasciar scongelare completamente prima di aggiungere il tampone di lisi. </li><li> Aggiungere 2 mg di lisozima per grammo di cellule, e incubare in ghiaccio con vortex occasionale per 30 min. </li><li> Aggiungere 20 mg / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 mg / ml RNAsi. Vortex e mettere in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone detergente a freddo per grammo di cellule. Mescolare bene e tenere RT per 5 min. </li><li> Trasferimento a 2 ml provette da centrifuga (diviso in due tubi, se necessario). Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone freddo Triton e risospendere completamente il pellet da sonicazione (3 impulsi x 5 sec x 50% di potenza con intervalli di 20 sec). NOTA: Avere il tubo in un piccolo bicchiere circondato da acqua ghiacciata per mantenerlo freddo durante la sonificazione. Nel caso di più tubi, combinare i corpi di inclusione risospeso in una provetta dopo risospensione. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 12.000xga 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Ripetere il punto 4.13 e 4.14 due volte. </li><li> Risospendere i corpi di inclusione in 1 ml di freddo TE con sonification per un lavaggio finale per rimuovere il buffer di Triton. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di freddo TE di sonificazione. </li><li> Valutare la concentrazione di proteine ​​con metodi standard come il saggio Bradford 19. Conservare aliquote dei corpi di inclusione a -20 ° C. </li></ol> 5. Ricostituzione Questo protocollo produce tipicamente 1-2 ml di proteine ​​ricostituito con un diametro esterno di 4 quando assorbanza viene misurata nella regione Qy (600-750 nm). Quantità può essere regolata a piacere, anche se occorre prestare attenzione per mantenere i rapporti corretti durante la procedura. <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: 2x Tampone di ricostituzione, il 20% OG, 2 M KCl, TE. Eseguire il seguente sPTO in penombra. </li><li> Risospendere 800 mg di corpi di inclusione LHC in un totale di 400 microlitri TE in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. Aggiungere 400 ml di tampone di ricostituzione 2x e vortex brevemente. </li><li> Aggiungere 0,6 ml di β-mercaptoetanolo (archivio 14.8 M) per avere una concentrazione finale di 10 mM. Riscaldare la proteina per 1 min a 98 ° C. Vortex brevemente e posto a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Risospendere 500 mg del totale dei pigmenti di clorofilla secchi più 80 mg pigmenti carotenoidi in 30 microlitri 100% EtOH vigorosamente vortex per 1 minuto o posto in un bagno sonicatore per 1-2 min. </li><li> Gira la miscela pigmento ~ 30 sec a 15.800 xg a 4 ° C e verificare che non vi è alcun pellet. Se c&#39;è un pellet, ripetere vortex e / o sonicazione. IMPORTANTE: Dopo la risospensione e centrifuga, aggiungere subito pigmento alla proteina, oppure può aggregare e dovrà essere risospeso di nuovo. </li><li> Aggiungere lentamente la miscela pigmento alla proteina raffreddato mentre vortex. Continuare a vortice 5-10 sec provetta e collocarla sul ghiaccio bagnato. Fare attenzione a non vortice troppo energicamente come la proteina può traboccare la parte superiore del tubo. </li><li> Aggiungere 94 ml di 20% Octyl β-D-glucopiranoside (OG) (concentrazione finale 2%), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 10 min. </li><li> Aggiungere 90 ml di KCl 2 M (concentrazione finale 150-200 mM), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 20 min. NOTA: Preparazione della colonna (sezione 6) possono essere avviati in questo momento. </li><li> Spin per 10 min a 15.800 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet (precipitato LDS) in una provetta da 10 ml. Mantenere freddo e al riparo dalla luce. </li></ol> 6 Nickel colonna di purificazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: tampone OG, buffer di risciacquo OG, tampone di eluizione. </li><li> Collegare una colonna Ni-Sepharose (1 ml) o equivalente ad una pompa peristaltica assicurare che l&#39;aria penetri all&#39;interno della colonna durante questa fase e le seguenti operazioni. </li><li> Impostare la velocità di tsi pompa a 1 ml / min e risciacquare la colonna con 5-10 ml di acqua per rimuovere la soluzione di archiviazione. </li><li> Equilibrare la colonna con 3-4 ml di tampone OG. </li><li> Aggiungere 3-4 ml di tampone OG al campione proteico e carico alla colonna. NOTA: se la proteina è stato seduto sul ghiaccio per più di 10 minuti dopo la rimozione di LDS, girare di nuovo a 15.800 xg a 4 ° C per 1 min per rimuovere qualsiasi precipitazione LDS aggiuntivo. </li><li> Lavare la colonna con 5 ml di tampone OG. </li><li> Lavare la colonna con 2 ml di tampone OG risciacquo. </li><li> Eluire le proteine ​​con 3 ml di tampone di eluizione. Raccogliere il eluire verde che contiene la proteina ricostituita. NOTA: Questo è di solito di circa 1 ml in totale. </li></ol> 7 centrifugazione in gradiente di saccarosio <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: soluzione di saccarosio, 0,06% β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Riempire i tubi ultracentrifuga con la soluzione di saccarosio e congelare a -20 ° CO / N or -80 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Togliere la provetta dal freezer e lasciare scongelare indisturbati a 4 ° C. NOTA: Il processo di congelamento / scongelamento crea un gradiente 0,1-1 M saccarosio. Un tubo da 15 ml si scioglie di solito in circa 3 ore. </li><li> Rimuovere con cautela dalla parte superiore lo stesso volume la frazione verde eluito dalla colonna Sepharose nichel al punto 6.8. Poi caricare il campione ricostituito in cima lentamente per evitare di disturbare il gradiente. </li><li> Saldo tubi e centrifugare a 200.000 xg a 4 ° C in un&#39;ultracentrifuga utilizzando un rotore secchio SW-41 o SW-60 oscillante per 18 ore, impostare a rallentare l&#39;accelerazione e arresto senza freni. </li><li> Togliere la sfumatura dal supporto tubo con una pinza. Utilizzare una siringa con un ago lungo che ha una apertura smussato per raccogliere la frazione dall&#39;alto. NOTA: In alternativa, raccogliere frazioni dal fondo forando il tubo con un ago e di raccolta gocce. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Le proteine ​​di membrana non sono così facili da studiare. Isolamento delle proteine ​​di membrana native è complicata dalla necessità di solubilizzare il doppio strato lipidico con detergenti, che possono danneggiare le proteine ​​e rimuovere cofattori essenziali. Queste proteine ​​possono essere presenti anche a bassi livelli nelle membrane biologiche, o essere mescolato con proteine ​​strettamente correlate, come nel caso dei complessi di raccolta della luce, che rende la purificazione dei singoli complessi difficili. Espressione della proteina eterologa in E. coli e ricostituzione in vitro offre la possibilità di evitare questi problemi. ricostituzione in vitro e purificazione di proteine ​​ripiegate risultati in complessi che possiedono caratteristiche molto simili a quelle dei complessi nativi 20,21,23 e quindi può essere usato per studiare complessi che non possono essere purificate all&#39;omogeneità 24 - 27. Questo metodo utilizza spinaci, che è facilmente attainabtutto l&#39;anno le, come fonte per il totale dei pigmenti carotenoidi e preparati. Per alcune ricostruzioni di proteine ​​native per le alghe, l&#39;uso di pigmenti purificati dalle alghe è preferito a causa di diverse composizioni pigmento. L&#39;a / b rapporto Chl e rapporto / auto Chl rimane lo stesso indipendentemente dalla fonte pigmento. È importante rendersi conto che l&#39;efficienza della ricostituzione è di solito intorno al 35% 28. Quindi è necessario rimuovere i pigmenti non vincolato e l&#39;apoproteina spiegato dalla soluzione dopo la ricostituzione. Un protocollo di purificazione a due fasi è presentato in questo protocollo (vedi anche i risultati). Tuttavia, va notato che la fase gradiente di saccarosio non permette la completa separazione di apo e olo-proteina. Per la maggior parte delle analisi questo non è un problema, in quanto la apoproteina non contiene pigmenti e quindi non interferisce con le misurazioni funzionali. Tuttavia, nel caso sia necessario rimuovere completamente l&#39;apoproteina dal frazione contenente il complesso ricostituito (per esempio, per calcolare il pigmento di proteina stechiometria), una colonna di scambio anionico può essere usato (vedere Passarini et al 2009 29 per i dettagli.). La capacità di ripiegare le proteine ​​ricombinanti di raccolta luce con pigmenti isolate in vitro offre la possibilità di &quot;manipolare&quot; i complessi modificando la ricostituzione &quot;ambiente&quot; in vari modi, cambiando così le caratteristiche del complesso risultante. Ad esempio, modificando la composizione del pigmento durante la ricostituzione può risultare in un complesso con la composizione del pigmento alterato. Questa caratteristica può essere utilizzata per studiare l&#39;influenza vari pigmenti hanno sulla struttura e la stabilità del complesso. Solitamente la preparazione pigmento ottenuto da spinaci ha un rapporto Chl a / b di 3: 1 e un rapporto / auto Chl di 2,9: 1. Questo rapporto produce tipicamente una proteina ricostituita con le stesse proprietà del native uno. Tuttavia, la regolazione del rapporto Chl a / b con l&#39;aggiunta di una o purificato Chl b può influenzare il legame di differenti pigmenti dovuti al variare selettività dei siti di legame 30-33. Ciò è possibile perché la maggior parte dei siti di legame di pigmento non sono completamente selettivo per Chl una o Chl b, ma può alloggiare, sebbene con differente affinità 10,30,34. In modo simile, i siti di legame di carotenoidi sono stati anche dimostrato di essere in grado di ospitare più di una specie xantofilla 8,35 - 38. Diverse ricostruzioni di CP26, un altro complesso pigmento-proteina di piante superiori, utilizzando varie composizioni di pigmento sono riportati nella tabella 2 39. Queste ricostruzioni sono stati utilizzati per valutare l&#39;affinità di siti per particolari pigmenti 39 vincolante. È interessante notare che, al fine di ottenere un complesso con lo stesso pigmento composizione come quella nativa, il rapporto Chl a / b della miscela pigmento deve essere di 3: 1. Questo sembra essere il caso per tutti i complessi LHC di piante superiori 20,40. La combinazione di biologia molecolare con la tecnica ricostituzione permette le proprietà di un complesso Chl vincolante da studiare più dettagliatamente. L&#39;importanza dei diversi domini proteici sulla stabilità e la piegatura dei complessi, o il loro coinvolgimento nelle interazioni proteina-proteina, sono stati determinati troncando il apoproteina o l&#39;esecuzione di mutagenesi casuale 8,41 - 44. Residui amminoacidici singolo importanti per il coordinamento dei diversi pigmenti possono essere modificati mediante mutagenesi sito-diretta per analizzare le proprietà dei singoli pigmenti o valutare il loro contributo alla funzione e la stabilità del complesso 10,28,29,45 - 52. La figura 6 mostra ricostituiti Lhcb4 (CP29) conuna mutazione della istidina in posizione 216 53. Un confronto della composizione pigmento di tipo selvatico e complessi mutanti mostra che la mutazione induce la perdita di una Chl una molecola, che indica che il sito mirato ospita un un Chl nel complesso WT. Le differenze degli spettri di assorbimento di WT e mutanti, sulla normalizzazione al contenuto di pigmento, mostra anche le proprietà di assorbimento del pigmento perduta. In questo caso, la differenza può essere visto nel picco principale a 680 nm, che indica che la Chl a coordinato da His216 assorbe a questa lunghezza d&#39;onda (per maggiori dettagli su questo mutante e le proprietà spettroscopiche vedono Mozzo et al. 2008 53). L&#39;analisi di mutazione può anche essere usato per determinare l&#39;effetto dell&#39;ambiente sulle proprietà spettroscopiche dei pigmenti 54. In conclusione, le proteine ​​di raccolta della luce possono facilmente essere ricostituito in vitro con conseguente pigmento-Protein complessi con proprietà molto simili a complessi nativi. In questo modo, le difficoltà di isolare proteine ​​native sono eliminati, offrendo anche la preparazione di proteine ​​con elevata resa e purezza per ulteriori studi. L&#39;importanza di un 3: 1 Chl rapporto a / b nella produzione di un complesso autentica è sottolineato, ed esempi di tipo selvatico ricostituito e LHCs mutanti sono forniti per illustrare le applicazioni della tecnica.

L&#39;apparato fotosintetico delle piante e alghe comprendono proteine ​​integrali di membrana che legano clorofilla a (chl a), b (chl b) e carotenoidi (auto). Questi complessi pigmento-proteina sono attive in energia luminosa raccolta e il trasferimento di energia di eccitazione che ai centri di reazione, dove viene utilizzato per promuovere la separazione di carica 2. Essi sono anche coinvolti in meccanismi di feedback regolatori che proteggono l&#39;apparato fotosintetico dai danni luce alta 3,4. I complessi di raccolta della luce (LHCs) sono costituiti da una grande famiglia di proteine ​​correlate nelle piante e alghe 5. La purificazione omogenea di ciascun membro della famiglia è stata complicata dalle proprietà chimiche e fisiche molto simili complessi. Inoltre, le procedure di purificazione causano spesso la perdita di pigmenti o altri potenziali cofattori, come i lipidi. In vitro rappre ricostituzionets un potente metodo per superare questi problemi. L&#39;LHC associato Fotosistema II (LHC-II) è stato ricostituito in vitro da Plumley e Schmidt nel 1987 1. I ricercatori hanno estratto proteico delipidato e pigmenti separatamente dai cloroplasti vegetali, e poi combinati proteina calore denaturato con pigmenti in presenza di Litio Dodecyl Sulfate (LDS), seguito da tre cicli di congelamento e scongelamento 1. Essi hanno dimostrato che le proprietà spettrali dei complessi LHC ricostituiti erano molto simili a complessi purificati dalle piante. La facilità di ricostituire LHC complessi pigmento-proteina, probabilmente a causa di qualche funzione di auto-assemblaggio inerente, insieme con la difficoltà di isolare complessi purificati da organismi, ha portato alla rapida adozione del metodo da altri ricercatori. La ricostituzione delle proteine ​​fotosintetiche sovraespresse in Escherichia coli (E. coli) è stato raggiunto da Paulsen e colleghi nel 1990 6. In E.coli, proteine ​​di membrana sovraespresse sono in genere contenute in corpi di inclusione, che loro servizi di depurazione. Ricostituzione è ottenuta attraverso denaturazione termica dei corpi di inclusione contenenti la proteina ricombinante in presenza di LDS, seguita dall&#39;aggiunta di pigmenti che avvia il ripiegamento delle proteine. Pieghevole del complesso LHCII è un processo in due fasi: in primo luogo, la clorofilla a è legato in meno di 1 minuto; secondo, clorofilla b è legato e stabilizzato nell&#39;arco di diversi minuti 7. Oltre a fornire comprensione delle dinamiche pieghevoli, in ricostituzione vitro in combinazione con mutagenesi sito-diretta ha permesso l&#39;individuazione di specifici aminoacidi importanti per la stabilità (ad esempio, 8,9) o coordinamento pigmento (ad esempio, 10). Manipolazione delle condizioni regolando parametri quali la composizione del pigmento o detergenti ripiegamento hanno inoltre individuato elementi critical per la corretta piegatura, come l&#39;obbligo di xantofille per il complesso LHCII (es, 1,11). Inoltre, studio delle proprietà dei singoli pigmenti legati ai complessi &#39;stato possibile utilizzando complessi ricostituiti in vivo (ad esempio, 10). Il metodo qui descritto inizia con isolamento di pigmenti (clorofille e carotenoidi) dal spinaci e il verde alga Chlamydomonas reinhardtii. L&#39;espressione e la purificazione di una proteina LHC da E. coli in forma di corpi di inclusione viene poi dettagliato, seguita dalla ricostituzione di LHC e successiva purificazione mediante colonna di affinità Ni. Nella fase finale, i complessi ricostituite sono ulteriormente purificati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio per rimuovere i pigmenti liberi e apoproteina spiegato. Questo protocollo rappresenta un procedimento ottimizzato incorpora varie modifiche che sono state introdotte da diversi laboratori oltretempo 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
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in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Nelle piante e alghe verdi, la luce viene catturato dai complessi luce-raccolta (LHCs), una famiglia di proteine ​​integrali di membrana che coordinano clorofille e carotenoidi. In vivo, queste proteine ​​sono piegati con pigmenti per formare complessi che vengono inseriti nella membrana tilacoidale del cloroplasto. L&#39;elevata somiglianza nelle proprietà chimiche e fisiche dei membri della famiglia, unitamente al fatto che essi possono facilmente perdere pigmenti durante l&#39;isolamento, rende la loro purificazione in uno stato nativo impegnativo. Un approccio alternativo per ottenere preparazioni omogenee di LHCs è stato sviluppato da Plumley e Schmidt nel 1987 1, che ha mostrato che era possibile ricostituire questi complessi in vitro a partire da pigmenti purificati e apoproteine ​​spiegate, con conseguente complessi con proprietà molto simili a quelle del nativo complessi. Questo apre la strada all&#39;uso delle proteine ​​ricombinanti espresse batteriche in vitro </em&gt; ricostituzione. Il metodo di ricostituzione è potente per vari motivi: (1) le preparazioni pure di singoli complessi possono essere ottenuti, (2) la composizione del pigmento può essere controllato per valutare il loro contributo alla struttura e funzione, (3) le proteine ​​ricombinanti possono essere mutati per studiare il funzionale ruolo dei singoli residui (ad esempio, siti di legame pigmento) o dominio proteine ​​(ad esempio, l&#39;interazione proteina-proteina, pieghevole). Questo metodo è stato ottimizzato in vari laboratori e applicato alla maggior parte dei complessi di luce raccolta. Il protocollo qui descritto in dettaglio il metodo di ricostituzione complessi luce-raccolta in vitro attualmente in uso nel nostro laboratorio, e sono forniti esempi che descrivono applicazioni del metodo.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K Views.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

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Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Ricerca

Biologia

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Ricostituzione biochimica dei recettori di steroidi • Complessi proteina Hsp90 e la riattivazione del Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

L&#39;analisi in vitro dei complessi CFTR PDZ-dipendenti macromolecolari di segnalazione

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Mapping basato AFM delle proprietà elastiche delle pareti cellulari: al Tissue, cellulare, e le risoluzioni subcellulari

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Creazione di una cultura clonale di alghe unicellulari coniugazione

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...