Questo protocollo consente un esame in vitro approfondito del microambiente ovarico. Consentire agli utenti di determinare la crescita e lo sviluppo del follicolo, nonché la steroidogenesi e l'abbondanza di molecole immunitarie. Un vantaggio di questa tecnica è la capacità di valutare direttamente i cambiamenti nel microambiente ovarico e nei follicoli emergenti e valutare l'interazione unica causata dall'aggiunta di ormoni specifici.
Questa tecnica può essere utilizzata per studiare una varietà di disturbi riproduttivi che causano arresti follicolari. Ad esempio, sindrome dell'ovaio policistico. Dal momento che possiamo valutare direttamente il microambiente ovarico in vitro, a dimostrare la procedura sarà Brooke Bell, una ricercatrice universitaria del mio laboratorio.
Usando una pinza mascellare cerata, fissare l'ovaio, tagliare a metà e iniziare a rimuovere le fette esterne. Garantire che non più di uno o due millimetri di profondità della superficie venga tagliato lontano dall'ovaio in modo che non venga raccolto alcun midollo. Tagliare tre o quattro strisce sottili della corteccia ovarica con un bisturi e posizionare le strisce nella terza capsula di Petri piena di PBS.
Tagliare le strisce in piccoli pezzi quadrati da 0,5 a un millimetro cubo con una lama di bisturi. Utilizzare un righello sotto le piastre di Petri per assicurarsi che i pezzi siano di dimensioni e spessore simili per creare pezzi di corteccia ovarica coerenti. Lavare i pezzi corticali ovarici in tutte e tre le piastre di Petri PBS e campo antibiotico, usando pinze a punta curva per spostare i pezzi tra i lavaggi.
Sposta i pezzi della corteccia attraverso la serie di lavaggi LB-15 e posizionali in una piastra di Petri finale piena di LB-15. Etichettare il coperchio con l'ID animale e il lato ovarico. Raccogli quattro pezzi di corteccia ovarica per ovaio e fissali per l'istologia del giorno zero e congela pezzi aggiuntivi per la purificazione dell'RNA.
Utilizzare i restanti pezzi di tessuto per la coltura. Preparare un armadio di sicurezza biologica per un lavaggio finale dei tessuti e la preparazione della coltura. Disinfettare le forniture con il 70% di etanolo prima di metterle nell'armadio di sicurezza biologica.
Spostare tutti i pezzi della corteccia ovarica destinati alla coltura nell'armadio di sicurezza biologica e lavarli ancora una volta in una capsula di Petri piena di LB-15. Pipettare 350 microlitri di Waymouth medium per pozzo in una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. Posizionare gli inserti del pozzo di coltura non rivestiti in ogni pozzetto usando una pinza assicurandosi che non si formino bolle sotto la base dell'inserto.
Posizionare con cura e delicatezza quattro pezzi di corteccia ovarica sulla rete di ciascun inserto senza forare la rete. Incubare il tessuto a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare la coltura della corteccia ovarica media ogni giorno per sette giorni assicurandosi di utilizzare il mezzo Waymouth preriscaldato.
Durante i cambi di mezzo, utilizzare una pinza per sollevare delicatamente l'inserto dal pozzo e raccogliere il mezzo Waymouth coltivato in tubi da 0,5 millilitri. Riposizionare l'inserto nel pozzetto e aggiungere 350 microlitri di terreno di coltura fresco erogandolo tra il lato dell'inserto e il pozzetto. Conservare il mezzo raccolto dalla coltura tissutale a meno 20 gradi Celsius.
Dopo sette giorni di coltura, immagina i pezzi della corteccia ovarica usando un microscopio di dissezione con una fotocamera collegata e un programma software di imaging per computer. Fissare due pezzi di corteccia ovarica per pozzetto nella soluzione di Bouin per l'istologia e il congelamento flash ai pezzi di corteccia ovarica in azoto liquido per ottenere RNA per cDNA. Ripeti questo passaggio per tutti i pozzetti con il tessuto, quindi raccogli il mezzo dal settimo giorno e conservalo meno 20 gradi.
Lasciare che i pezzi della corteccia ovarica rimangano immersi nella soluzione di Bouin per circa 1,5 ore, quindi lavarli con etanolo al 70% tre volte, mantenere il tessuto in etanolo al 70% e pulirlo ogni giorno fino a quando la soluzione non è più gialla. La colorazione di ematossilina ed eosina è stata eseguita per follicoli primordiali, follicoli primari precoci, follicolo primario, follicolo secondario e follicolo antrale. La stadiazione del follicolo è stata condotta su una corteccia ovarica fissata prima e dopo la coltura per valutare la follicologenesi.
La differenza nella morfologia determinata dalla deposizione di collagene può indicare fibrosi nella corteccia ovarica da gradini o giovenche di controllo. Un confronto dell'area media della colorazione rossa positiva di picrosirius per corteccia ovarica riempita tra le giovenche di controllo e le giovenche a gradini è mostrato qui. La raccolta giornaliera del terreno di coltura è stata raggruppata in tre giorni per valutare la produzione di vari ormoni steroidei, utilizzando un test radioimmunologico.
I metaboliti steroidei e la produzione di citochine sono stati misurati anche nel terreno di coltura della corteccia ovarica da un pozzetto per ogni animale raggruppato in quattro giorni di coltura. Più a lungo il tessuto si siede, più difficile può essere lavorare. Potrebbe essere necessario praticare tagli precisi.
Questa tecnica viene utilizzata per comprendere gli effetti sulle vie di trasduzione del segnale per salvare l'eccesso di steroidogenesi per determinare gli effetti degli steroidi in eccesso sulla produzione di citochine e chemochine e per determinare gli effetti sulla progressione o l'arresto del follicolo all'interno del tessuto ovarico.
