Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della leucemia linfocitica cronica, come la prognosi accurata dei pazienti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, veloce e altamente accurata. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso una robusta prognosticazione, in particolare certificazioni di rischio con pazienti con leucemia linfocitica cronica perché l'accurata prognosticazione può successivamente definire la gestione terapeutica della malattia.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, ad esempio la selezione del prodotto PCR e i tipi di analisi della sequenza di digest sono difficili da imparare perché richiedono precisione ed esperienza. Per iniziare questa procedura, aggiungere 200 microlitri di EDTA a un tubo di raccolta sterile da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di sangue periferico e 15 millilitri di mezzo RPMI al tubo e pipetta su e giù da due a tre volte per mescolare.
Aggiungere quindi 15 millilitri di gradiente di densità medio a un nuovo tubo di raccolta da 50 millilitri. Sovrapporre lentamente la soluzione di sangue periferico sul mezzo gradiente di densità, assicurandosi che non interrompa il gradiente. Centrifuga a 800 volte G per 20 minuti con il freno di centrifuga spento.
Quindi utilizzare una pipetta Pasteur sterile per raccogliere l'anello cellulare mononucleare che si è formato tra lo strato piastrinica al plasma superiore e lo strato medio gradiente di densità e trasferirlo in un nuovo tubo sterile di raccolta da 15 millilitri. Aggiungere il mezzo RPMI in modo che il volume finale sia di 12 millilitri e pipettare la soluzione su e giù per mescolare. Centrifuga a 800 volte G per otto minuti.
Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare con 10 millilitri di mezzo RPMI. Centrifugare di nuovo a 750 volte G per otto minuti. Successivamente, scartare il supernatante e sciogliere il pellet cellulare in un millilitro di PBS.
Utilizzando una nuova piastra Bauer, formare un conteggio delle cellule mescolando 20 microlitri di campione e 80 microlitri di una o 10 soluzioni turche. Se la lavorazione a valle del campione non è programmata per lo stesso giorno, centrifugare il campione a 750 volte G per otto minuti. Scartare il supernatante e conservare il pellet di cellule a meno 80 gradi Celsius.
In primo luogo, preparare la miscela di primer utilizzando quantità equimolari di ogni primer del sottogruppo per garantire un'amplificazione imparziale. Mescolare i reagenti PCR elencati nella tabella due del protocollo di testo. Aggiungere 0,5 microlitri di TAP polimerasi al tubo PCR contenente i reagenti PCR misti.
Quindi, aggiungere 100 nanogrammi di gDNA o due microlitri di cDNA. Eseguire il protocollo PCR termico come descritto nella tabella tre del protocollo di testo. Successivamente, verificare la presenza di prodotti PCR di circa 500 coppie di basi quando si utilizzano primer IGHV litri o 350 coppie di basi quando si utilizzano le miscele di primer IGHPFR1.
Per iniziare la purificazione del prodotto PCR, caricare il volume totale del prodotto PCR su un gel di agarosio a bassa fusione del tre per cento. Consentire ai prodotti PCR di funzionare sul gel fino a quando non si separano dallo sfondo. Asportare le bande PCR prominenti e quindi purificarle ed eluirle.
Se vengono rilevati due riarrangiamenti, entrambe le bande devono essere asportate e sequenziate separatamente. Per eseguire la pulizia exo-sap, seguire le istruzioni del produttore relative ai volumi specifici da utilizzare. Vortice delicatamente ogni campione per mescolarli e incubarli su un blocco PCR a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Inattivare gli enzimi riscaldandoli a 85 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, caricare una piccola quantità di prodotti PCR su un gel di agarosio del tre per cento per valutare la purezza del prodotto. L'ultimo checkpoint prima del sequenziamento è determinare la clonalità del campione utilizzando l'analisi dei frammenti.
Per iniziare ad analizzare la sequenza, avviare il software appropriato. Specificare la specie, ad esempio l'homo sapiens, e il tipo di recettore o locus. Esegui il passo delle sequenze da analizzare in formato fasta e includendo gli identificatori nell'area di testo in lotti fino a 50 sequenze per esecuzione.
Quindi, scegliere una delle tre opzioni di visualizzazione seguenti per i risultati. Vista dettagliata:scegliete questa opzione per ottenere singolarmente i risultati per ogni sequenza. Vista di sintesi:scegliere questa opzione per compilare una tabella di riepilogo ordinata dal gene IGHV e dal nome dell'allele o dall'ordine di input della sequenza.
Questa opzione fornisce anche un allineamento delle sequenze che in qualsiasi batch inviato sono assegnate allo stesso gene E allele IGHV e, infine, al file Excel. Scegliere questa opzione per fornire tutti i file di output come fogli di calcolo incorporati in un unico file. Solo l'uso di primer da litro IGHV consente l'amplificazione dell'intera lunghezza dell'IGHV riorganizzato, consentendo così di determinare il vero carico HSM.
Il prodotto PCR previsto è di circa 500 coppie di basi. In rari casi in cui i primer da litro IGHV non possono amplificare il riarrangiamento clonotipico IG, possono essere utilizzati primer IGHBFR1. Il prodotto PCR previsto è di circa 350 coppie di basi.
Le sequenze ottenute vengono quindi analizzate utilizzando lo strumento IMG TV Quest. La prima riga della tabella dei risultati afferma la funzionalità della sequenza, poiché una sequenza riarrangiata IG può essere produttiva o improduttiva. Un riarrangiamento genico IGH è improduttivo è che i codoni stop sono presenti all'interno della regione VDJ e /o se il riarrangiamento è fuori dal fotogramma a causa di inserimenti / deduzioni.
È importante notare che solo i riarrangiamenti produttivi e quindi funzionali dovrebbero essere ulteriormente analizzati. Quando si utilizzano i parametri predefiniti di IMG TV Quest, gli inserimenti e le eliminazioni non vengono rilevati automaticamente, tuttavia indicazioni forti che una sequenza può portare tali modifiche sono fornite dallo strumento e un avviso appare sotto la tabella di riepilogo dei risultati. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di atterrare i prodotti PCR sul gel abbastanza a lungo in modo che il legame clonale possa essere discriminato dallo sfondo policlonale.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunogenetica della leucemia linfocitica cronica per esplorare l'impatto prognostico dello stato di epimutazione somatica nei pazienti. Non dimenticare che lavorare con il bromuro di etilico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come lavorare sotto il cofano in ogni momento dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
