Questo metodo può aiutare a fornire informazioni chiave nel campo dell'oncologia come l'identificazione di geni bersaglio putativi e meccanismi patogeni per sviluppare potenziali interventi terapeutici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può rilevare l'interazione di NFAT2 e altri fattori di trascrizione con geni bersaglio noti e nuovi. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché le condizioni ottimali di fissazione e taglio sono difficili da stabilire.
Per iniziare riempire un tubo da 1,5 millilitri con un millilitro di formaldeide al 37%. Quindi riempire un altro tubo da 1,5 millilitri con un millilitro di glicina molare 1,25 in un tubo da cinque millilitri con quattro millilitri di PBS. Successivamente, dopo la stimolazione delle cellule girare le cellule secondo il protocollo di testo, e sospendere di nuovo le cellule in 500 microlitri di PBS e posizionare il tubo in una scatola piena di ghiaccio.
Aggiungere 13,5 microlitri di formaldeide al 37% alle cellule e mescolare pipettando su e giù. Quindi incubare la sospensione a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 57 microlitri di glicina molare 1,25 per interrompere la fissazione.
E lasciare che la sospensione incuba a temperatura ambiente per cinque minuti. Immediatamente dopo il periodo di incubazione posizionare le cellule sul ghiaccio e centrifugare le cellule a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi aspira il supernatante.
Successivamente, lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS ghiacciato a 200 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il supernatante. Rimescolare il pellet cellulare in cinque millilitri di tampone di lysis uno tubazione su e giù. Quindi mettere i campioni sul ghiaccio e incubarli con tremori per 10 minuti.
Successivamente, centrifuga i tubi a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi utilizzare una pipetta per rimuovere con cura il supernatante. Omogeneizzare le cellule in cinque millilitri di tampone di lysis due e pipettare su e giù per mescolare.
Quindi incubare le cellule sul ghiaccio per 10 minuti con tremori. Dopo il periodo di incubazione centrifugare i tubi a 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere con cura il supernatante. Successivamente, rimescolare il pellet cellulare nel tampone di taglio uno con inibitore della proteasi 1X.
Quindi incubare la sospensione cellulare sul ghiaccio per 10 minuti. Trasferire 140 microlitri della sospensione cellulare in tubi sonicatori facendo attenzione a evitare di formare bolle d'aria. Posizionare i tubi in un ultrasuonatore focalizzato a sette gradi Celsius e tagliare per 10-7 e 1/2 minuti.
Trasferire la sospensione cellulare in tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i campioni a 15.700 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere il supernatante in un nuovo tubo. In primo luogo, preparare 20 microlitri di perline rivestite con proteina A per ogni precipitazione in un tubo da 1,5 millilitri.
Lasciare che le perline si sistemino su un rack magnetico per un minuto e rimuovere il supernatante. Quindi lavare le perline con 40 microlitri di tampone di chip 1X uno per ogni 20 microlitri di perline rivestite con proteina A pipettando su e giù. Lasciare che le perline si sistemino su un rack magnetico per un minuto e rimuovere il supernatante.
Ripetere questo processo di lavaggio altre tre volte prima di sospendere di nuovo le perline nel volume originale di 1X chIP buffer one. Aggiungere l'inibitore della proteasi BSA, il buffer chIP 5X e l'acqua di grado ChIP-seq alle perline. Aggiungere quindi la cromatina tranciata.
Utilizzare 10 microgrammi di anticorpo anti-NFAT2 per catturare NFAT2 e 2,5 microgrammi di anticorpo IgG come controllo. Incubare le miscele durante la notte a quattro gradi Celsius su una ruota che ruota a sei giri/min. Il giorno dopo gira i tubi per cinque secondi a 7.000 volte G e incubali sul rack magnetico per un minuto.
Quindi aspirare il supernatante e lavare le perline una volta con tamponi di lavaggio uno, due, tre e quattro consecutivamente. Ruotare i tubi per cinque secondi a 7000 volte G prima di incubare i tubi sul rack magnetico per un minuto. Successivamente, rimuovere il supernatante e aggiungere il successivo tampone di lavaggio.
Dopo l'ultimo lavaggio, ruotare i tubi per cinque secondi a 7000 volte G.Incubare i tubi sul rack magnetico per un minuto. Rimuovere il supernatante e prendere le perline in 100 microlitri di tampone di eluizione uno. Quindi incubare i tubi sulla ruota rotante per 30 minuti.
Quindi, ruotare brevemente i tubi e posizionarli su un rack magnetico per un minuto. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e aggiungere quattro microlitri di tampone di eluizione due. Per creare il controllo dell'ingresso mescolare un microliter della cromatina tranciata con 99 microlitri di tampone di eluizione uno e quattro microlitri di tampone di eluizione due.
Quindi incubare i campioni per quattro ore a 65 gradi Celsius con tremori. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di isopropanolo al 100% ai tubi. Vortice e far girare i campioni per cinque secondi a 7000 volte G.Quindi aggiungere 10 microlitri di perline magnetiche a ciascun campione.
Vortice e incubare i campioni su una ruota rotante a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, ruotare brevemente i tubi e posizionarli su un rack magnetico per un minuto. Aspirare il supernatante e rimescolare le perline in 100 microlitri di tampone di lavaggio uno.
Invertire i tubi per mescolarli e incubarli per cinque minuti su una ruota rotante a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare brevemente i tubi. Posizionarli in un rack magnetico per un minuto e utilizzare una pipetta per rimuovere il supernatante.
Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio due. Invertire i tubi per mescolarli e incubarli per cinque minuti su una ruota rotante a temperatura ambiente. Successivamente, centrifugare brevemente i tubi e metterli in un rack magnetico per un minuto.
Rimuovere il tampone di lavaggio due tramite aspirazione e riprestare le perline in 55 microlitri di tampone di eluizione. Per elutare il DNA precipitato incubare i campioni in una ruota rotante a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, ruotare brevemente i tubi e metterli in un rack magnetico per un minuto.
Infine, trasferire il supernatante su nuovi tubi da 1,5 millilitri. Questo protocollo è stato eseguito per la prima volta con celle Jurkat che analizzano LCK come potenziale obiettivo NFAT2. Come mostrato qui, i risultati ottimali sono stati documentati da un significativo arricchimento del controllo positivo IL-2 e del DNA LCK.
La cesoia non ottimale o la fissazione mancante possono portare a DNA di scarsa qualità. Infine, questo protocollo è stato eseguito con cellule CLL umane primarie con CD40L che funge da controllo positivo e LCK come obiettivo sperimentale. Come dimostrato dal forte arricchimento del DNA LCK, LCK è un bersaglio NFAT2 diretto nelle cellule CLL umane primarie.
Una tosatura inadeguata con conseguente DNA di scarsa qualità può restituire risultati non ottimali. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che i passaggi di fissazione e sonicazione sono cruciali per il successo di questo metodo e potrebbero dover essere adattati alle celle analizzate.
