Ringraziamo il Neoplasie Unità linfoide, Elisa dieci Hacken, Lydia Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, e Angela Cattaneo. Questo progetto è stato sostenuto da: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant e Programma Speciale di Oncologia Molecolare Clinica - 5 per mille 9965 #) CS e BA progettato lo studio, eseguito gli esperimenti, hanno analizzato i dati e scritto il manoscritto. MTSB, UR, FBPR assistito nella scrittura del manoscritto. PG e FCC progettati campioni Lo studio ha fornito dei pazienti e dati clinici.

NOTA: Tutti i campioni di tessuto sono stati ottenuti con l&#39;approvazione del Comitato Etico dell&#39;Ospedale San Raffaele (Milano, Italia). 1 campioni di tessuti umani e purificazione delle cellule (Figura 1) NOTA: i linfociti leucemiche sono stati ottenuti da sangue periferico (PB) di pazienti affetti da LLC, diagnosticati secondo Mulligan et al 9. 1.1) La separazione delle cellule leucemiche da PB <ol><li> Raccogliere PB in provette di raccolta del sangue con vacutainer sodio eparina. </li><li> Trasferire il sangue in una provetta da 15 ml e aggiungere B-cellula umana arricchimento cocktail a 50 ml / ml di sangue intero. Mescolare bene e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire il campione con un uguale volume di PBS + 2% FBS, mescolare il sangue con delicatezza e con attenzione overlay sul Ficoll, facendo attenzione a non rompere l&#39;interfaccia. Utilizzare almeno 1 parte di Ficoll a 2 parti di campione diluito (cioè 4 ml Ficoll + 10 ml di sangue in 15 ml tube). </li><li> Centrifugare a 400 xg, a temperatura ambiente (20 ° C) per 20 minuti senza freno. Le cellule mononucleari saranno all&#39;interfaccia. </li><li> Aspirare accuratamente l&#39;interfaccia per recuperare le cellule e inserire in un nuovo tubo. Lavare le cellule una volta con PBS e centrifugare a 300 xg, a 4 ° C al buio per 5 min. Il pellet sarà in basso. </li><li> Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente muovendo il tubo avanti e indietro con le dita. Diluire il pellet con 10 ml di mezzo completo RPMI (RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale di vitello e 15 mg / ml di gentamicina) e contare le cellule con il metodo di esclusione Trypan Blue. </li></ol> 1.2) Valutazione Purezza NOTA: La purezza di tutti i preparati deve essere sempre superiore al 99%. <ol><li> Incubare 100 ml di sospensione cellulare purificata con i seguenti anticorpi (disponibili in commercio, vedi Tabella dei Materiali): CD3 FITC (5 microlitri / TESt), CD14 PE (5 ml / test), CD19 ECD (6 ml / test), CD16-CD56 PC5 (2 ml / test), CD5 PC7 (4 ml / test), per 20 minuti a 4 ° C in un tubo FACS. </li><li> Lavare il campione con 4 ml di PBS (centrifugare per 5 min a 300 xg) e controllare la purezza del flusso cytometry.Check nella trama la% di cellule CLL (&gt; 99%), che co-esprimono CD19 e CD5 sulla loro superficie come mostrato nella Figura 1 (6). Assicurarsi che i preparativi sono praticamente privi di NK, linfociti T e monociti controllando la% di CD3, CD14 e CD16-56 nella trama, che dovrebbe essere vicino allo zero. </li></ol> 1.3) I campioni di archiviazione <ol><li> Per gli studi di proteomica, raccogliere 25 x 10 6 cellule in una provetta da 1,5 ml, cellule centrifugare a 300 xg per 10 min, scartare il surnatante e lyophilize pellet per 4 ore. Conservare a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Per i test di validazione, risospendere le cellule in RPMI completo (quantità dipende l&#39;ulteriore analisi che èscelta) e procedere con il punto 4. </li></ol> 2. elettroforesi bidimensionale (2-DE) (Figura 2) 2.1) Isoelettrofocalizzazione (IEF) <ol><li> Solubilizzare cellule CLL pellet con un volume finale di 380 microlitri di buffer 2-DE (344 ml di una soluzione di RBthio (9 M Urea, Tris 10 mM, 4% CHAPS), 30 ml di 65mm DTT, 6 ml di 2% IPG buffer di ampholine pH 4-7). </li><li> Applicare campioni di proteine ​​(1 mg) per 18 strisce IPG (pH 4-7) e di eseguire IEF seguente protocollo standard come descritto da Conti et al. 10 </li><li> Equilibrare le strisce in 2 ml di tampone per l&#39;equilibrazione (EB: 50 mM tampone pH 8.8 Tris-HCl contenente 6 M urea, 30% glicerolo, 2% SDS), integrato con il 2% di fresco DTT, per 15 minuti a RT. Eliminare EB + DTT e aggiungere 2 ml di EB integrato con 2,5% Iodoacetamide. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li></ol> 2.2) SDS-PAGE <ol><li> Asciugare le strisce su carta senza toccare il gel per rimuoverel&#39;eccesso di EB. Caricare ogni striscia sulla cima di un gradiente di gel SDS-PAGE 9-16%. Aggiungere una piccola quantità di SDS-elettroforesi Buffer (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% w / v) sulla parte superiore del gel per facilitare il caricamento del nastro. </li><li> Sigillare il gel con l&#39;aggiunta di ~ 5 ml di soluzione di agar (0,8%) per evitare di galleggiamento della striscia, quindi montare l&#39;unità elettroforetica e riempire con tampone SDS-elettroforesi. Eseguire la corsa a 60 mA / gel per 4 ore a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il gel dall&#39;unità elettroforetico e inserirlo nella casella colorazione corretta. </li></ol> 2.3) Macchia d&#39;argento per la preparativa Gel <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> 50% Metanolo 12% di acido acetico 0,05% formalina </td><td> 2 ore (o tutta la notte) * </td></tr><tr><td> TAMPONE DI LAVAGGIO </td><td> 35% Ehanol </td><td> 20 min (ripetere l&#39;operazione per tre volte) </td></tr><tr><td> SENSIBILIZZAZIONE </td><td> 0,02% di sodio tiosolfato </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5 min (ripetere il passo tre volte) </td></tr><tr><td> ARGENTO NITRATO </td><td> 0,2% di nitrato d&#39;argento 0,076% formalina </td><td> 20 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1 min (ripetere il passaggio due volte) </td></tr><tr><td> SVILUPPATORE </td><td> 6% di sodio carbonato 0,0004% di sodio tiosolfato 0,05% di formalina </td><td> Fino a quando la colorazione è sufficiente </td></tr><tr><td> Stop </td><td> 50% Metanolo </td><td> 30 min </td></tr><tr><td></td><td> * 2 ore è il tempo minimo richiesto per la fissazione delle proteine </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. NOTA: spot proteici possono essere visualizzati mediante colorazione gel con MS macchia d&#39;argento compatibile 11. Tutte le soluzioni necessarieper la colorazione argento sono elencati nella Tabella 1. <ol><li> Preparare circa 200 ml di ciascuna soluzione / gel e procedere come indicato nella tabella 1. Aggiungere con cautela ogni soluzione alla casella di colorazione contenente il gel. Eseguire tutte le incubazioni su una piattaforma oscillante. </li><li> Dopo la colorazione, rimuovere la soluzione di arresto e lasciare il gel in una soluzione di 1% di acido acetico fino acquisizione. </li></ol> 2.4) Gel Acquisizione e Analisi <ol><li> Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando un densitometro entro 3 giorni dalla colorazione. </li><li> Analizzare 2-D modelli di proteine ​​utilizzando il software per i gel 2-DE. NOTA: Il software permette una comparazione di immagini veloce e affidabile. <ol><li> Creare un progetto scegliendo &quot;creare un nuovo progetto&quot; dal menu contestuale. Creare una cartella e importare i gel scegliendo &quot;immagini gel di importazione&quot; con tif, png. o .gel estensione. </li><li> Una volta che i gel sono importati e aggiunti al workspasso, eseguire un rilevamento automatico posto selezionando il gel per la rilevazione spot e scegliendo &quot;Modifica&gt; punto&gt; individuare&quot; nel menu. </li><li> Successivamente, eseguire uno sfondo sottrazione selezionando dal menu &quot;sfondo sottrarre&quot;. Nota: Dopo di che è possibile confrontare più gel e per rilevare differenze o somiglianze di analisi quantitativa e / o qualitativa. </li></ol></li></ol> 3. Proteina Identificazione mediante MALDI-TOF MS analisi (Figura 3) 3.1) digestione delle proteine <ol><li> Sciacquare il gel con acqua e accise luoghi di interesse da gel sia dal manuale (tagliando con un bisturi pulito) o escissione automatico. </li><li> Lavare particelle di gel con acqua (100-150 ml), spin down (30 sec a 400 xg) e rimuovere il liquido. </li><li> Aggiungere un volume uguale (a seconda del volume di gel) di CH 3 CN ai pezzi di gel e attendere 10-15 minuti fino a quando i pezzi di gel ridursi. Asciugare le particelle di gel ina centrifuga a vuoto. </li><li> Aggiungi 75-100 ml di Dithioerythritol 10 mM diluito in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare per 30 minuti a 56 ° C (riduzione Step). Shrink nuovamente i pezzi di gel con CH 3 CN come descritto al punto 3.1.3. </li><li> Procedere con alchilazione con l&#39;aggiunta di 75-100 ml di una soluzione 55 mM Iodoacetamide diluito in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Shrink i pezzi di gel ancora una volta con CH 3 CN con un volume sufficiente a coprire i pezzi di gel come descritto al punto 3.1.3. Secco in una centrifuga a vuoto. </li><li> Reidratare le particelle in un tampone contenente 25 mM di NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2, e 12,5 ng / ml di tripsina a 4 ° C per 20 min. Utilizzare un volume sufficiente di tampone per coprire i pezzi di gel. Rimuovere il surnatante non-assorbita dai pezzi di gel e aggiungere 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2 senza tripsina di COVer il gel. </li><li> Lasciare campioni a 37 ° C per almeno 3 ore (il tempo minimo richiesto per la digestione peptide) per una notte. </li></ol> 3.2) Spettrometria di Massa Analisi (tecnica di goccia secchi) <ol><li> Spot 1 ml aliquota di ogni campione su una piastra MALDI acciaio inox e mescolare con 1 ml di α-ciano-4-idrossicinnamico acido come matrice, preparati nel 50% CH 3 CN e 0,1% TFA. </li><li> Ottenere spettri di massa su uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Accumulare circa 200 spettri al posto, regolando intensità del laser per evitare la saturazione del segnale o per aumentare il segnale. Spettri Process via software Data Explorer come descritto di seguito: <ol><li> Importare il file dat ed eseguire la correzione al basale scegliendo &quot;processo&gt; Correzione della linea di base&quot;. Calibrare masse utilizzando i prodotti tripsina autolisi e picchi di matrice scegliendo &quot;processo&gt; Calibrazione di massa&gt; calibrazione manuale; selezionare picchi vicino a m / z 855,1 e 2163,1 by lasciato trascinare e selezionare le corrispondenti masse di riferimento, quindi fare clic su &quot;complotto&quot; e &quot;si applicano calibrazione&quot; nella finestra di calibrazione manuale. </li><li> Regolare la soglia di rilevamento di picco (&quot;peak&gt; rilevamento di picco&quot;), duplicare la traccia attiva (&quot;visualizzazione&gt; duplicare traccia attiva&quot;), selezionare la nuova traccia ed eseguire il deisotoping (&quot;picco&gt; deisotoping&quot;). Utilizzando la macro &quot;getpeaklist&quot;, generare un elenco di masse da utilizzare per l&#39;identificazione. Se necessario, rimuovere manualmente i segnali di rumore raccolte da picchi per pulire la lista e ottenere una migliore identificazione. </li></ol></li><li> Identificare le proteine ​​ricercando un database completo di proteine ​​non ridondante con profonda e mascotte come i motori di ricerca 12. <ol><li> Utilizzare i seguenti parametri in tutte le ricerche: un mancato clivaggio per ogni peptide, metionina ossidazione come modifica variabile, cisteina carbamidomethylation come modifica fisso e un initiAl tolleranza massa di 50 ppm. </li></ol></li></ol> 4. citoscheletro Attività saggi (Figura 4) NOTA: Risospendere le cellule purificate nel passo 1 a completo RPMI (10 6 cellule / 200 ml). 4.1) Migrazione Assay. Questo test consente la quantificazione della capacità migratoria delle cellule analizzate (linfociti). Utilizzare una camera transwell di 6,5 mm di diametro e 5,0 micron dimensione dei pori ed eseguire il test in triplice copia. Ottimizza le dimensioni dei pori e tempo di migrazione (Step 4.1.3) nel caso di diversi tipi di cellule. <ol><li> Preparare la camera inferiore con l&#39;aggiunta di 600 ml di RPMI completo con o senza gli stimoli specifici (cioè SDF-1) per misurare la e la migrazione spontanea indotta rispettivamente. </li><li> Mettere la camera superiore su di esso e lasciare che il sistema equilibrare per 30 minuti a 37 ° C in incubatore. </li><li> Seed 10 6 cellule / 200 microlitri nella camera superiore (numero totale delle cellule) e incubarela piastra per 4 ore a 37 ° C in incubatore. </li><li> Rimuovere la camera superiore, raccogliere i media nella camera inferiore e lavare la camera inferiore una volta con 1 ml di PBS. Raccogliere il PBS nel tubo. </li><li> Centrifugare 5 minuti a 300 xg, scartare il surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS. </li><li> Mediante citometria di flusso, contare il numero di cellule migrate dopo 1 min di acquisizione. Nel caso di una popolazione cellulare isolata non è necessario aggiungere alcun anticorpo superficie. Controllare il numero di cellule in un diagramma a punti bidimensionale considerando le disperde laterali delle cellule e il numero di eventi visualizzati in 1 min, che è il numero da utilizzare per il calcolo. </li><li> Calcolare l&#39;Indice di migrazione (MI) come: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg" /></li></ol> 4.2) saggi di adesione. Questo test consente di misurare la capacità di adesione delle cellule. Eseguire il test in triplice copia. <ol><li> Pre-coat 96-wells piastra (a fondo piatto) con 50 ml / pozzetto di una delle 2% BSA-PBS (come sfondo) o 1 mg ICAM-1 diluito in PBS, una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la piastra due volte con PBS e bloccare i siti non specifici con l&#39;aggiunta di 2% BSA-PBS (100 l / pozzetto) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Nelle cellule frattempo risospendere a 5 x 10 6 / ml in RPMI completo, etichettarli con inseguitore cellulare 1 mM CMFDA-verde e incubare 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 1 x 10 6 cellule / pozzetto ai pozzetti pre-rivestite dopo aver scartato la soluzione di saturazione (punto 4.2.2) e incubare 1 ora a 37 ° C. </li><li> Quantificare l&#39;adesione utilizzando un lettore ELISA (eccitazione del filtro: 485 nm, filtro di emissione: 535 nm). Eseguire una prima misura sul totale in ingresso (INPUT). </li><li> Lavare la piastra delicatamente con 2% BSA-PBS (200 ml / pozzetto) 4 volte (x). Eseguire una lettura della piastra dopo ogni lavaggio (Adesione x). </li><li> Dopo la sottrazione del fondo per ogni misurazione, calcolare ADHES specificiion (adesione): <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg" /></li></ol> 4.3) test di polimerizzazione. Questo è un saggio colorimetrico che quantifica F-actina polimerizzazione. Eseguire il test in triplice copia. <ol><li> Risospendere 1x10 ^ 6 cellule in 100 ml di pre-riscaldato completo RPMI e aggiungere lo stimolo specifico (ad esempio α-IgM 20 mg / ml) per 10 min. </li><li> Arrestare la reazione con 400 ml di paraformaldeide al 4% e fissare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con PBS (centrifugare a 300 xg per 5 min, 4 ° C). </li><li> Eliminare le cellule surnatante e permeabilize con PBS-saponina 0,2% (200 ml) in ghiaccio per 2 min. </li><li> Lavare 3 volte con PBS-saponina 0,1% (centrifugare a 100 xg per 5 min, 4 ° C), scartare il surnatante e risospendere in 100 microlitri di PBS-saponina 0,1%. </li><li> Colorare con falloidina-AlexaFluor 488 (3 mg / ml) per 30 minuti a T ambienteemperatura nel buio. </li><li> Lavare 3 volte con PBS-0.1% saponine. Eliminare il supernatante e risospendere in 300 microlitri di PBS. </li><li> Quantificare la quantità di F-actina mediante citometria a flusso, calcolare l&#39;intensità media Florescence (MFI) del falloidina. Analizzare i dati generati in un singolo appezzamento dimensione per produrre un istogramma basato sull&#39;intensità fluorescente, il valore di MFI viene mostrato nel report grafico. </li><li> Misurare polimerizzazione F-actina (Δ F-actina) come: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg" /></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> Lo scopo di questo manoscritto è di descrivere un protocollo ottimizzato per l&#39;identificazione di molecole coinvolte nella patogenesi della LLC, anche se questo approccio può essere esteso ad altre malattie e / o altri tipi di campioni 16-18. Confrontando i profili proteomici di 2 sottogruppi di pazienti con LLC, buoni vs cattivi prognosi 19, abbiamo dimostrato che differiscono per lo stato di fosforilazione di HS1 e che la sua attivazione colpisce la migrazione e l&#39;adesion...

Leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia dell&#39;adulto più comune nei paesi occidentali, deriva dall&#39;accumulo di monoclonali CD5 + linfociti B neoplastici ed è clinicamente molto eterogenea. Può essere presente come una forma di pre-leucemiche, definito come linfocitosi monoclonale delle cellule B (MBL) 1,2,3. In altri casi la malattia può apparire sia con un decorso clinico indolente, che può rimanere stabile per anni prima di avere bisogno del trattamento, o come una malattia chemorefractory progressiva con prognosi infausta nonostante la terapia. Infine, si può progredire in un linfoma di alto grado spesso letali (sindrome di Richter-RS) 2,3,4. I pazienti sono di solito classificati in due sottogruppi principali: il bene e il male prognosi, sulla base di un insieme di fattori prognostici che fornisce informazioni complementari sui predittori di outcome malattia e la sopravvivenza. Eterogeneità clinica probabilmente riflette l&#39;eterogeneità biologica. Un certo numero di genetica, microambientali e cefattori llular hanno dimostrato di concorrere alla patogenesi della malattia anche se sono stati trovati 5 meccanismi unificanti. In particolare, diversi studi hanno dimostrato che le differenze nel decorso clinico della malattia può essere in parte spiegato con la presenza (o l&#39;assenza) di alcuni marcatori biologici che hanno un valore prognostico 6,7,8. Questi dati hanno dimostrato che una migliore comprensione della biologia della malattia potrebbe fornire spunti ulteriori per la gestione clinica della patologia, tramite l&#39;identificazione di entrambi i marcatori prognostici e bersagli terapeutici. L&#39;obiettivo del presente lavoro è quello di mostrare come una combinazione di diverse tecniche di proteomica può essere utilizzato per l&#39;identificazione di proteine ​​coinvolte nella LLC insorgenza e la progressione. Il nostro approccio dimostra che è possibile unire insieme proteomica di base e dati clinici 5. Nella presente flusso di lavoro, primarie cellule leucemiche di pazienti selezionati(Buono vs cattivo prognosi) sono isolati e lisati cellulari vengono poi utilizzati per ottenere mappe proteomiche. 2DE permette la caratterizzazione del profilo proteomico di una popolazione di cellule, comprese le modificazioni post-traduzionali, dando così informazioni indirette sull&#39;attività biologica di ciascuna proteina. Lisati cellulari totali vengono risolti da una prima pista di dimensione in base al punto isoelettrico, seguita da una seconda dimensione eseguito su un gel di poliacrilammide che risolve le proteine ​​in base al loro peso molecolare. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l&#39;identificazione delle proteine ​​differenzialmente espresse (sia in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) come macchie sul gel che possono essere tagliati e analizzati da spettrometria di massa. Il ruolo di ciascun candidato può essere poi sfruttata da diversi saggi. Tale approccio, limitato alla CLL nel manoscritto corrente, può essere facilmente esteso ad altre malattie / campioni, fornendo così informazioni sulla proteomic / differenze biologiche tra i due gruppi (cioè patologiche vs normale, stimolati vs non stimolato, wild-type vs knockdown).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="796">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Acetonitril</td>
			<td style="width:160px;">MERCK</td>
			<td style="width:111px;">61830025001730&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">A6141-500G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">1,4-Dithioerythritol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">D9680-5G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Iodoacetamide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">I6125-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">223506-25G</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:160px;">ROCHE</td>
			<td style="width:111px;">11418475001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td style="width:111px;">T6580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">ZipTip&#181;-C18</td>
			<td>MILLIPORE</td>
			<td>ZTC18M096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>15064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PBS</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB4004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">FBS</td>
			<td>DOMINIQUE DUTSCHER</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Lymphoprep</td>
			<td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td>
			<td>1114547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Trypan Blue</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD19</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07770</td>
			<td>ECD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD5</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07754</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD3</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07746</td>
			<td>FITC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD14</td>
			<td>BD</td>
			<td>345785</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD16</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07767</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CD56</td>
			<td>BECKMAN COULTER</td>
			<td>082A07789</td>
			<td>PC5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:160px;">GE-Healthcare</td>
			<td>11-0033-64&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Urea</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Tris-Hcl Buffer</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CHAPS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2020-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DTT</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D9163-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGstrips</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-1233-01&#160;</td>
			<td>Linear pH 4-7 18cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IPGbuffer</td>
			<td>GE-Healthcare</td>
			<td>17-6000-86</td>
			<td>pH 4-7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Glycerol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-3188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDS</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acrilamide</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Agarosio</td>
			<td>INVITROGEN</td>
			<td>16500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Methanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Acetic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Formalin</td>
			<td>BIO-OPTICAL</td>
			<td>05-K01009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9832500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>72049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Silver Nitrate</td>
			<td>FLUKA</td>
			<td>85228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageMaster 2D Platinum 5.0</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sodium Carbonate</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>A0250292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">MALDI-TOF Voyager-DE STR</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Data Explorer software (version 3.2)&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">transwell chambre 6.6 mm diameter</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>3421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">RPMI</td>
			<td>EUROCLONE</td>
			<td>ECB2000L</td>
			<td>WITH L-GLUTAMINE</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Gentamicin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">SDF-1</td>
			<td>PREPROTECH</td>
			<td>300-28A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flat-bottom 96-well plate</td>
			<td>BECTON DICKINSON</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">BSA</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">ICAM-1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>720-IC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">CMFDA</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>C7025</td>
			<td>Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">IgM</td>
			<td>SOUTHERNBIOTECH</td>
			<td>2020-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Saponine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S-7900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Phalloidin&#160;</td>
			<td>Life Thechnology</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Alexa fluor 488</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from a 2de-gel spot to protein function: lesson learned from hs1 in chronic lymphocytic leukemia

L&#39;identificazione di molecole coinvolte nell&#39;iniziazione e progressione tumorale è fondamentale per la biologia comprensione della malattia e, di conseguenza, per la gestione clinica dei pazienti. Nel presente lavoro descriviamo un approccio proteomico ottimizzato per l&#39;identificazione di molecole coinvolte nella progressione della leucemia linfocitica cronica (CLL). Nel dettaglio, lisati di cellule leucemiche sono risolte da 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e visualizzate come &quot;macchie&quot; sui gel 2DE. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l&#39;identificazione delle proteine ​​differenzialmente espressi (in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) che vengono raccolti, isolato e identificato da spettrometria di massa (MS). La funzione biologica dei candidati individuati può essere controllata con diversi saggi (cioè la migrazione, adesione e polimerizzazione F-actina), che abbiamo ottimizzato per le cellule leucemiche primarie.

Abbiamo isolato le cellule B leucemiche primarie formano PB di pazienti affetti da LLC e abbiamo analizzato le mappe proteomiche. I campioni (n = 104) sono stati raggruppati in due sottoinsiemi principali in base alle caratteristiche cliniche di ciascun paziente (cattiva prognosi vs buona prognosi) ed è stata eseguita l&#39;analisi comparativa dei gel 2DE. L&#39;identificazione analisi ha permesso di spot differenzialmente espressi tra i due sottoinsiemi (in termini di presenza / a...

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From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l&#39;identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

from-2de-gel-spot-to-protein-function-lesson-learned-from-hs1-chronic

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Views.  IRCCS, San Raffaele Scientific Institute.  Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici. 

Video: From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic processes that prepare the alimentary canal for digestion. Steady progress is being made towards understanding the early biochemical and molecular events underlying taste transduction (for a review, Breslin and Spector, 20081). However, progress to date has largely resulted from animal models. Yet, since marked differences in receptor specificity and receptor density vary among species, human taste transduction will only be understood by using human taste tissue. Here we describe a biopsy technique to collect human fungiform papillae, visible as rounded pink anterior structures, about 0.5 mm in diameter that contain taste buds. These biopsied papillae are used for several purposes including the isolation of viable taste bud cells, in situ hybridization, immunohistochemistry and, through techniques of molecular biology, the identification of taste-specific novel proteins.

Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Knowledge of molecular mechanisms underlying gustatory transduction has recently enjoyed significant advances, largely due to using animal models. However, the wide diversity in taste sensitivity and specificity among mammals warrants studies in human tissue. We describe a biopsy technique to collect living taste cells from the papillae on human tongue.

Tecnica per raccogliere fungiformi (Gusto) Papille da lingua umana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

Ricerca

Medicina

Utilizing Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation to Improve Language Function in Stroke Patients with Chronic Non-fluent Aphasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this experiment, we demonstrate the administration of low-frequency repetitive TMS (rTMS) to an optimal stimulation site in the right hemisphere in patients with chronic non-fluent aphasia. A battery of standardized language measures is administered in order to assess baseline performance. Patients are subsequently randomized to either receive real rTMS or initial sham stimulation. Patients in the real stimulation undergo a site-finding phase, comprised of a series of six rTMS sessions administered over five days; stimulation is delivered to a different site in the right frontal lobe during each of these sessions. Each site-finding session consists of 600 pulses of 1 Hz rTMS, preceded and followed by a picture-naming task. By comparing the degree of transient change in naming ability elicited by stimulation of candidate sites, we are able to locate the area of optimal response for each individual patient. We then administer rTMS to this site during the treatment phase. During treatment, patients undergo a total of ten days of stimulation over the span of two weeks; each session is comprised of 20 min of 1 Hz rTMS delivered at 90% resting motor threshold. Stimulation is paired with an fMRI-naming task on the first and last days of treatment. After the treatment phase is complete, the language battery obtained at baseline is repeated two and six months following stimulation in order to identify rTMS-induced changes in performance. The fMRI-naming task is also repeated two and six months following treatment. Patients who are randomized to the sham arm of the study undergo sham site-finding, sham treatment, fMRI-naming studies, and repeat language testing two months after completing sham treatment. Sham patients then cross over into the real stimulation arm, completing real site-finding, real treatment, fMRI, and two- and six-month post-stimulation language testing.

We explore the use of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to improve language abilities in patients with chronic stroke and non-fluent aphasia. After identifying a site in the right frontal gyrus for each patient that responds optimally to stimulation, we target this site during ten days of rTMS treatment.

Utilizzando la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva per migliorare la funzione Language in pazienti con ictus con cronica non-fluente Afasia

Transcranial magnetic stimulation (TMS) has been shown to significantly improve language function in patients with non-fluent aphasia1. In this ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Sangue secco Spot Raccolta di salute biomarcatori per massimizzare la partecipazione negli studi di popolazione

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Urinary Bladder Distention Evoked Visceromotor Responses as a Model for Bladder Pain in Mice

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized by increased urgency and frequency of urination, as well as nocturia and general pelvic pain, especially upon bladder filling or voiding. Despite years of research, the cause of IC/BPS remains elusive and treatment strategies are unable to provide complete relief to patients. In order to study nervous system contributions to the condition, many animal models have been developed to mimic the pain and symptoms associated with IC/BPS. One such murine model is urinary bladder distension (UBD). In this model, compressed air of a specific pressure is delivered to the bladder of a lightly anesthetized animal over a set period of time. Throughout the procedure, wires in the superior oblique abdominal muscles record electrical activity from the muscle. This activity is known as the visceromotor response (VMR) and is a reliable and reproducible measure of nociception. Here, we describe the steps necessary to perform this technique in mice including surgical manipulations, physiological recording, and data analysis. With the use of this model, the coordination between primary sensory neurons, spinal cord secondary afferents, and higher central nervous system areas involved in bladder pain can be unraveled. This basic science knowledge can then be clinically translated to treat patients suffering from IC/BPS.

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition characterized in part by pelvic pain. In order to study nervous system contributions to the condition, a physiological model of urinary bladder pain is used in mice and rats.

Vescica urinaria Distensione Evocati visceromotoria Risposte come un modello per il dolore della vescica nei topi

Approximately 3-8 million people in the United States suffer from interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), a debilitating condition ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

Valutazione della funzione vascolare nei pazienti con malattia renale cronica

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. As this technology expands and improves, the ability to potentially evaluate and improve the quality of substandard lungs prior to transplant is a critical need. In order to more rigorously evaluate these approaches, a reproducible animal model needs to be established that would allow for testing of improved techniques and management of the donated lungs as well as to the lung-transplant recipient. In addition, an EVLP animal model of associated pathologies, e.g., ventilation induced lung injury (VILI), would provide a novel method to evaluate treatments for these pathologies. Here, we describe the development of a rat EVLP lung program and refinements to this method that allow for a reproducible model for future expansion. We also describe the application of this EVLP system to model VILI in rat lungs. The goal is to provide the research community with key information and &#8220;pearls of wisdom&#8221;/techniques that arose from trial and error and are critical to establishing an EVLP system that is robust and reproducible.

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed lung transplantation in humans to become more readily available by enabling the ability to assess organs and expand the donor pool. Here, we describe the development of a rat EVLP program and refinements that allow for a reproducible model for future expansion.

Metodo di isolato<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusion in un modello di ratto: Lezioni apprese da Sviluppo di un programma EVLP Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

Tromboembolica cronica Ipertensione polmonare e valutazione dei ventricolare destra Funzione nel Maialino

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and progress in this site. The model presented in the current report utilizes human primary bone marrow stromal cells and osteoblasts as two representative cell types from the marrow niche that influence tumor cell phenotype. The in vitro co-culture conditions described for human leukemic cells with these primary niche components support the generation of a chemoresistant subpopulation of tumor cells that can be efficiently recovered from culture for analysis by diverse techniques. A strict feeding schedule to prevent nutrient fluxes followed by gel type 10 cross-linked dextran (G10) particles recovery of the population of tumor cells that have migrated beneath the adherent bone marrow stromal cells (BMSC) or osteoblasts (OB) generating a "phase dim" (PD) population of tumor cells, provides a consistent source of purified therapy resistant leukemic cells. This clinically relevant population of tumor cells can be evaluated by standard methods to investigate apoptotic, metabolic, and cell cycle regulatory pathways as well as providing a more rigorous target in which to test novel therapeutic strategies prior to pre-clinical investigations targeted at minimal residual disease.

Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro

The current report summarizes a protocol that can be utilized to model the influence of the bone marrow microenvironment niche on leukemic cells with emphasis placed on enrichment of the most chemoresistant subpopulation.

Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

It is well established that the bone marrow microenvironment provides a unique site of sanctuary for hematopoietic diseases that both initiate and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical activity and longer life expectancy. Despite its increasing prevalence, the underlying pathogenesis still remains unclear, and treatment is generally symptomatic. Recently, numerous therapeutic options, including growth factors, stem cells, and gene therapy, were investigated in hopes of enhancing the healing potency of the degenerative tendon. However, the majority of these research studies were conducted only on animal models or healthy human tenocytes. Despite some studies using pathological tenocytes, to the best of our knowledge there is currently no protocol describing how to obtain human degenerative tenocytes. The aim of this study is to describe a standard protocol for acquiring human degenerative tenocytes. Initially, the tendon tissue was harvested from a patient with lateral epicondylitis during surgery. Then biopsy samples were taken from the extensor carpi radialis brevis tendon corresponding to structural changes observed at the time of surgery. All of the harvested tendons appeared to be dull, gray, friable, and edematous, which made them visually distinct from the healthy ones. Tenocytes were cultured and used for experiments. Meanwhile, half of the harvested tissues were analyzed histologically, and it was shown that they shared the same key features of tendinopathy (angiofibroblastic dysplasia or hyperplasia). A secondary analysis by immunocytochemistry confirmed that the cultured cells were tenocytes with the majority of the cells having positive stains for mohawk and tenomodulin proteins. The qualities of the degenerative nature of tenocytes were then determined by comparing the cells with the healthy control using a proliferation assay or qRT-PCR. The degenerative tenocyte displayed a higher proliferation rate and similar gene expression patterns of tendinopathy that matched previous reports. Overall, this new protocol might provide a useful tool for future studies of tendinopathy.

In vitro use of degenerative tenocytes is essential when investigating the efficacy of novel treatment on tendinopathy. However, most research studies use only the animal model or a healthy tenocyte. We propose the following protocol to isolate human degenerative tenocytes during surgery.

Un protocollo per acquisire il Tenocyte degenerativa dagli esseri umani

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ~6.5M people and cost ~$40B/year in the US alone. Although a significant effort has been invested in understanding how chronic wounds develop in humans, fundamental questions remain unanswered. Recently, we developed a novel mouse model for diabetic chronic wounds that have many characteristics of human chronic wounds. Using db/db-/- mice, we can generate chronic wounds by inducing high levels of oxidative stress (OS) in the wound tissue immediately after wounding, using a one-time treatment with inhibitors specific to the antioxidant enzymes catalase and glutathione peroxidase. These wounds have high levels of OS, develop biofilm naturally, become fully chronic within 20 days after treatment and can remain open more for more than 60 days. This novel model has many features of diabetic chronic wounds in humans and therefore can contribute significantly to advancing fundamental understanding of how wounds become chronic. This is a major breakthrough because chronic wounds in humans cause significant pain and distress to patients and result in amputation if unresolved. Moreover, these wounds are very expensive and time-consuming to treat, and lead to significant loss of personal income to patients. Advancements in this field of study through the use of our chronic wound model can significantly improve health care for millions who suffer under this debilitating condition. In this protocol, we describe in great detail the procedure to cause acute wounds to become chronic, which has not been done before.

Chronic wounds are developed from acute wounds on a diabetic mouse model by inducing high levels of oxidative stress after a full-thickness cutaneous wound. The wound is treated with inhibitors for catalase and glutathione peroxidase, resulting in impaired healing and biofilm development by bacteria present in the skin microbiome.

Protocollo per creare ferite croniche nei topi diabetici

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

Da un 2DE-Gel Spot Proteine Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica