Finanziamento è da Evans Medical foundation finanziamenti dal Boston Medical Center così come un sub-contratto da NIH 5R01CA183101, pilota di BU-CTSI concedere 1UL1TR001430, BU-Joslin programma pilota e BU-CTSI KL2TR001411.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di Boston Medical Center.
1. impostazione sistema
<ol><li>Sistema di oSLO<ol>
<li>Utilizzare una sorgente laser di supercontinuum come la sorgente laser di sistema.<ol>
<li>Separare la gamma della luce visibile (450-650 nm) da gamma di lunghezza d'onda superiore (650-2000 nm) da uno specchio dicroico (DM1). Ampliano la gamma con una coppia di prismi dispersivi dopo il fascio passa attraverso un divisore di fascio di polarizzazione (PBS).</li>
			<li>Posto una fessura per selezionare l'intervallo di lunghezza d'onda di eccitazione (475-495 nm). Utilizzare uno specchio riflettente per riflettere il fascio filtrato torna alla coppia prisma e quindi coppia la luce in una fibra monomodale (SMF 1).</li>
			<li>Utilizzare uno spettrometro per confermare la selezione di lunghezza d'onda in uscita della fibra monomodale.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Collegare la fibra monomodale a due accoppiatori di fibra ottica in cascata come mostrato nella Figura 2. Uno della porta di uscita di fibra dalla seconda fibra accoppiatore trasporta la luce per il sistema di oSLO.</li>
		<li>Collimare il laser prima nel sistema di oSLO.<ol>
<li>Deviare il laser da uno specchio di galvanometro (GM1). Relè di un secondo specchio galvanometro (GM2) di un sistema di 1:1 telescopio il laser e ulteriormente relè alla pupilla dell'occhio di un sistema di 3:1 telescopio.</li>
			<li>Installare uno specchio dicroico (DM2) all'interno del sistema di telescopio di 3:1 in modo da riflettere i segnali di fluorescenza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montare il sistema telescopio di 3:1 e lo specchio dicroico (DM2) su un dispositivo di scorrimento di coda colomba su misura per compensare l'asse ottico e creare l'obliquo scansione illuminazione come mostrato in Figura 3. Utilizzare una pinza per controllare con precisione la lunghezza dell'offset come desiderato.</li>
		<li>Percorso ottico imaging di fluorescenza.<ol>
<li>Riflettere la fluorescenza dallo specchio dicroico e relè per il terzo specchio galvanometro de-scansione la scansione lenta.</li>
			<li>Inoltro alla luce di una lente obiettiva imaging di un altro sistema di 1:1 telescopio. Installare l'ottica sopra su una fase di traduzione. Nota: Due fasi di traduzione aggiuntivi vengono installati sotto il terzo specchio galvanometro (GM3) per fornire ridondanza nei gradi di libertà per ottimizzare l'imaging.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montare un sistema di imaging finale su un palco che ha tre gradi di libertà (rotazione e due assi di traduzione). Utilizzare una fotocamera planare per catturare le immagini a sezione trasversale di fluorescenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistema di tomografia ottica di coerenza<ol>
<li>Utilizzare la stessa sorgente laser supercontinuum come la sorgente laser di sistema.<ol>
<li>Separare l'intervallo vicino infrarosso (NIR) (650-900 nm) dalla luce restante (650-2000 nm) un altro specchio dicroico (DM3). Utilizzare un filtro di passaggio lungo per limitare ulteriormente la larghezza di banda a 800-900 nm. Coppia il fascio in una fibra monomodale (SMF 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Collegare la fibra di singolo modo per l'altra porta di ingresso degli accoppiatori fibra ottica in cascata due da combinare con l'eccitazione di oSLO blu. Orientare la luce dalla seconda porta di uscita dell'accoppiatore della fibra secondo al braccio di riferimento OCT, che ha un filtro a densità neutra variabile (VNDF), piastre di compensazione di dispersione e uno specchio riflettente. Nota: La luce restituito dal braccio di riferimento e l'occhio ricombina presso il secondo accoppiatore di fibra ottica e viene consegnato allo spettrometro OCT per raccogliere il segnale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Acquisizione dati<ol>
<li>Utilizzare un software di sistema di acquisizione dei dati scritti in LabVIEW e modificata dal protocollo di scansione di OCTA7,8,9,10. Per ogni B-scan, un ciclo di dovere di 80% ha visto dente con 500 gradini è uscita da una scheda di uscita analogica (AO1) per controllare la x' veloce scansione specchio, GM2.</li>
		<li>Attivare la videocamera di scansione riga ad ogni passo di acquisire i dati di personalizzazione di Office solo quando lo specchio è in avanti in direzione di scansione. Impostare il tempo di esposizione per la fotocamera di scansione riga per essere 17 µs.</li>
		<li>Per acquisire il segnale OCTA, ripetere la misurazione 5 volte nella stessa posizione B-scan.</li>
		<li>Impostare la frequenza di uscita AO a 100 kHz e il tasso di a-line OCT a 50 kHz. Controllare il y' specchio scansione lento, GM1, di una forma d'onda in rampa. Sincronizzare lo specchio de-scansione, GM3, con GM1 per-analizzare la scansione lenta.</li>
		<li>Attivare la videocamera planare da un'altra scheda di output analogico (AO2) per acquisire una sola immagine fluorescente presso ogni y' posizione. Ritagliare le dimensioni della formazione immagine o bin i pixel vicini per aumentare la velocità e la sensibilità come desiderato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sistema di allineamento
<ol><li>Regolare la fessura nella sorgente di luce di oSLO per selezionare la lunghezza d'onda di eccitazione blu. Utilizzare uno spettrometro per monitorare l'intervallo spettrale per essere intorno 475-490 nm.</li>
	<li>Regolare il dispositivo di scorrimento Monte di coda colomba per spostare l'asse ottico di ~ 5 mm. Questo si tradurrà in un offset presso la pupilla del ratto di ~1.7 mm, risultante in un angolo obliquo di ~ 15° sulla retina.</li>
	<li>Regolare la fase di traduzione dell'ottica di rilevazione di fluorescenza la stessa 5 mm.</li>
	<li>Regolare la fluorescenza finale sistema per essere ~ 30° di imaging.</li>
	<li>Misurare la potenza ottica utilizzando un misuratore di potenza. Assicurarsi che il potere di eccitazione blu oSLO è ≤ 0.2 mW e l'OCT laser potenza ≤ 0,8 mW, che non causerà danni retina. Nota: Basato sullo standard ANSI, la massima esposizione permissiva (MPE) alla retina è al livello del ~ 2mW7,8 nella gamma di luce visibile. Secondo la formula di Delori et al. 9, l'errore massimo tollerato per la luce infrarossa vicino è circa due volte superiore rispetto alla luce visibile, a circa 4 mW.</li>
</ol>3. in Vivo esperimento sugli animali
<ol><li>Trasferire un topo lungo Evans maschio 12 settimane nella camera di induzione. Anestetizzare il topo con isoflurano 4,5% in ossigeno per 10 minuti con una portata di 2 L/min di un vaporizzatore di isoflurane.<ol>
<li>Confermare la profondità dell'anestesia, come determinato da una mancanza del riflesso di ritiro durante un pizzico interdigital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'induzione, posto il ratto su un supporto di 5 assi (x, y, traduzioni di z, imbardata e beccheggio). Fornire calore supplementare di uso di un piatto riscaldato, circolazione acqua calda coperta o altro metodo adatto in un esperimento prolungato. Mantenere l'anestesia al 1,5% di surrenalectomia con una portata di 2 litri/minuti durante la restante parte dell'esperimento. Quando non si utilizza una camera di induzione con scarico attivo, la camera di induzione dovrebbe essere posta su un tavolo backdraft o del downdraft o sotto un boccaglio per pulire isoflurano.</li>
	<li>Dilatare la pupilla con soluzione oftalmica di Tropicamide 1% per 2 minuti. Applicare 0,5% tetracaina HCl soluzione oftalmica sull'occhio del ratto per ulteriore anestesia locale, se necessario. Tenere l'occhio idratata con lacrime artificiali commerciali almeno una volta ogni minuto durante l'esperimento.</li>
	<li>Iniettare sale della fluorescina (10% w/w) o FITC (10% w/w) diluito in soluzione salina sterile (0.1-0.3 mL) attraverso la vena della coda con un 1 mL siringa e un G 29 ago.</li>
	<li>Accendere la sorgente laser. Posto un filtro a densità neutra per attenuare la luce blu di eccitazione durante l'allineamento. Misurare la potenza della luce OCT per essere ~0.8 mW e la luce blu < 0.01 mW per evitare la formazione di cataratte.</li>
	<li>Avviare la modalità di scansione e allineamento del galvanometro. Regolare l'altezza della palla dell'occhio per rendere un laser fissi spot sulla cornea. Regolare la posizione dell'occhio del ratto per rendere il cerchio della pupilla approssimativamente perpendicolare al laser e compensare il laser al centro apicale dell'occhio per circa ~1.5 mm.</li>
	<li>Regolare ulteriormente il titolare animale finché non immagini di ottobre raggiungono una qualità ottimale. In x' direzione di scansione veloce, assicurarsi che l'immagine di B-scan trasversale appare piatto. Quando si passa alla y' lento direzione scansione, assicurarsi che l'immagine di B-scan a sezione trasversale appare inclinata, a causa della scansione obliqua.</li>
	<li>Rimuovere il filtro a densità neutra per l'eccitazione di luce blu e monitorare il tempo reale feed dalla fotocamera. Immagine fluorescente sezionale trasversale dovrebbe apparire visualizzando vasi sanguigni che appaiono in diverse profondità.<ol>
<li>Regolare la messa a fuoco della fluorescenza finale sistema per raggiungere la messa a fuoco ottima di imaging. Consentire una regolazione fine della posizione dell'occhio nel piano laterale per raggiungere una qualità immagine ottimale oSLO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'allineamento, iniziare ad acquisire OCTA simultanea e l'angiografia della fluorescina volumetrica (vFA).</li>
	<li>Costruire immagini volumetriche per OCTA e oSLO in Matlab. Gli algoritmi sono precedentemente descritto in dettaglio10. Generare vasculatures retinica risolta in profondità di segmentazione di immagini.</li>
	<li>Dopo aver completato l'imaging, disattivare il laser, rilasciare l'animale e applicare una pomata oftalmica sugli occhi e poi metti l'animale in una scatola di recupero.</li>
	<li>Non lasciare l'animale incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale o come per politica istituzionale.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope.">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li><li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography.">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li><li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+(OCTA).">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration.">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li><li>Chen, C. -. L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography+based+angiography+[Invited].">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li><li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy.">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li><li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer.">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li><li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+(ANSI+2000),+with+emphasis+on+ophthalmic+devices.">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+(oSLO).">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li></ol>

Ji Yi detiene un brevetto in sospeso per oSLO. Altri autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Qui, abbiamo descritto oSLO, una in vivo volumetrico fluorescente imaging retinico tecnica con un FOV oltre 30 °. Rispetto al ott, un attuale standard di cura imaging metodo in Oftalmologia, oSLO offre una simile capacità di imaging 3D ancora permette di contrasto di fluorescenza che OCT non è sensibile a. Il vantaggio di oSLO è che richiede solo una scansione raster e così permette la perfetta combinazione di OCT, fornendo due tecniche complementari per imaging volumetrico strutturale e fluorescente.
<...

Oftalmologia e visione scienza beneficiare grandemente le moderne tecniche di imaging ottiche, poiché la retina è facilmente raggiungibile con la luce. L'imaging retinico di fluorescenza è uno strumento essenziale nella diagnosi e nella gestione delle malattie vascolari corioretiniche come retinopatia diabetica (Dott) e degenerazione maculare senile (AMD), entrambi i quali sono principali cause di cecità negli Stati Uniti.
Tuttavia, è ancora difficile da acquisire un ampio campo visivo (FOV), imaging mediante fluorescenza imaging tridimensionale retinico (3D). Fotografia del fondo non ha la capacità di risoluzione di profondità e non rifiuta la luce diffusa. Di conseguenza, la miscelazione dei segnali provenienti da differenti profondità riduce la qualità dell'immagine. Oftalmoscopia di scansione laser (SLO) e confocale può SLO (cSLO) ridurre l'effetto di luce diffusa mediante gating confocale1. Tuttavia, è difficile per SLO o cSLO per acquisire un'immagine della retina umana 3D a causa del limite della loro profondità di fuoco. Ottica adattiva SLO (AOSLO) attraverso la correzione per le aberrazioni di wavefront introdotte dall'occhio umano, in grado di fornire eccellente risoluzione e contrasto. Tuttavia, AOSLO avrebbe ancora bisogno z-stacking per imaging volumetrico2. Optical coherence tomography (OCT)3 e sistemi di angiografia (OCTA) OCT superano queste restrizioni per fornire tridimensionale (3D) immagini anatomiche e vascolare4,5,6, ma la natura privo di tintura di ottobre non visualizzi perdita indicativo di disfunzione vascolare.
Questo protocollo descrive una nuova piattaforma multimodale per retinica fluorescenza volumetrica 3D imaging, vale a dire obliquo scansione laser oftalmoscopia (oSLO). In questo sistema di imaging, una scansione obliqua è generata da un dispositivo di scorrimento della coda di colomba, e un sistema di imaging finale è allineato in un angolo per rilevare la fluorescenza Croce immagini sezionali. Il sistema utilizza metodi di scansione laser, e queste tecniche permettono facile incorporazione con OCT come una modalità di imaging volumetrica strutturale complementare. La risoluzione corrente di profondità è di circa 25 µm nella retina del ratto e del campo visivo è di 30°. Essenzialmente, l'oSLO permette una versione fluorescente di OCT e contemporaneamente combinabile con OCT e OCTA sopra un grande FOV.
In questo protocollo, descriviamo il programma di installazione di oSLO, il metodo di allineamento e di costruzione, il metodo di imaging in vivo della retina del ratto e i risultati rappresentativi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Supercontinuum Laser Source</td>
			<td>NKT Photonics</td>
			<td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP650R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM2)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ZT514/1064rpc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic Mirror (DM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DMLP900R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-460B-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Mode Fiber (SMF 2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>P3-780A-FC-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic Fiber Coupler</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TW850R5A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-150-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-50-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:1 Telescope System</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AC254-100-A&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galvo Mirrors (GM1,GM2)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS201&#215;2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-sacn Galvo Mirrors (GM3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GVS011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective Lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanSApo 20&#215;/0.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UplanFL N 10&#215;/0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Final imaging system</td>
			<td>Computar</td>
			<td>12-36mm/1:2.8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>PCO</td>
			<td>Pco.pixelfly usb</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted Continuously Variable ND Filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NDC-50C-4M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Line Scan Camera</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SPL2048-140K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO1)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCI-6731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Output Board (AO2)</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>PCIe-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long pass filter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FEL0800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multimodal volumetric retinal imaging by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oslo) and optical coherence tomography (oct)

Mentre la formazione immagine di fluorescenza è ampiamente usata in Oftalmologia, un'immagine retinica di tridimensionale (3D) fluorescenza ampio campo visivo (FOV) è ancora una grande sfida con state-of-the-art retinico modalità di formazione immagine perché richiederebbero z-accatastamento a compilare un dataset volumetrico. Più recente tomografia a coerenza ottica (OCT) e sistemi di angiografia (OCTA) OCT superano queste restrizioni per fornire immagini anatomiche e vascolare di tridimensionali (3D), ma la natura privo di tintura di ottobre non visualizzi perdita indicativo di vascolare disfunzione. Questo protocollo descrive un romanzo obliquo scansione laser oftalmoscopia (oSLO) tecnica che fornisce immagini retiniche fluorescenza volumetrica 3D. Il programma di installazione del sistema di imaging genera la scansione di un dispositivo di scorrimento di coda colomba obliquo e allinea il sistema di imaging finale ad un angolo di rilevare immagini a sezione trasversale fluorescente. Il sistema utilizza il metodo di scansione laser e permette quindi una facile incorporazione di ottobre come una modalità di imaging volumetrica strutturale complementare. In vivo imaging su retina del ratto è dimostrato qui. Soluzione di fluorescina è iniettato per via endovenosa per produrre l'angiografia della fluorescina volumetrica (vFA).

Figura 4a Mostra un'immagine di OCT a sezione trasversale di una retina di ratto. Figura 4b c -4 mostrano le stesse immagini a sezione trasversale della retina di vFA OCTA e oSLO acquisito allo stesso tempo. L'oSLO consente a sezione trasversale FA analoga a OCT B-scan. In confronto a OCTA, l'immagine della sezione trasversale di oSLO vFA identifica chiaramente i vasi strato delle fibre nervose (NFL) e strato del...

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Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere un ampio campo visivo (FOV) tridimensionale (3D) fluorescenza e immagine retinica OCT utilizzando una nuova piattaforma di imaging multimodale. Introdurremo l'installazione del sistema, il metodo di allineamento e i protocolli operativi. In vivo imaging sarà dimostrato, e saranno forniti risultati rappresentativi.

Multimodale Imaging retinico volumetrica da Oblique scansione Laser oftalmoscopia (oSLO) e tomografia a coerenza ottica (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

multimodal-volumetric-retinal-imaging-oblique-scanning-laser

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

8.4K Views.  Boston University School of Medicine. Qui, presentiamo un protocollo per ottenere un ampio campo visivo (FOV) tridimensionale (3D) fluorescenza e immagine retinica OCT utilizzando una nuova piattaforma di imaging multimodale. Introdurremo l'installazione del sistema, il metodo di allineamento e i protocolli operativi. In vivo imaging sarà dimostrato, e saranno forniti risultati rappresentativi.

Video: Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy oSLO and Optical Coherence Tomography OCT

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

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Integrated Photoacoustic Ophthalmoscopy and Spectral-domain Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging technologies. Existing retinal imaging modalities, such as fundus photography1, confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO)2, and optical coherence tomography (OCT)3, have significant contributions in monitoring disease onsets and progressions, and developing new therapeutic strategies. However, they predominantly rely on the back-reflected photons from the retina. As a consequence, the optical absorption properties of the retina, which are usually strongly associated with retinal pathophysiology status, are inaccessible by the traditional imaging technologies.
Photoacoustic ophthalmoscopy (PAOM) is an emerging retinal imaging modality that permits the detection of the optical absorption contrasts in the eye with a high sensitivity4-7 . In PAOM nanosecond laser pulses are delivered through the pupil and scanned across the posterior eye to induce photoacoustic (PA) signals, which are detected by an unfocused ultrasonic transducer attached to the eyelid. Because of the strong optical absorption of hemoglobin and melanin, PAOM is capable of non-invasively imaging the retinal and choroidal vasculatures, and the retinal pigment epithelium (RPE) melanin at high contrasts 6,7. More importantly, based on the well-developed spectroscopic photoacoustic imaging5,8 , PAOM has the potential to map the hemoglobin oxygen saturation in retinal vessels, which can be critical in studying the physiology and pathology of several blinding diseases 9 such as diabetic retinopathy and neovascular age-related macular degeneration.
Moreover, being the only existing optical-absorption-based ophthalmic imaging modality, PAOM can be integrated with well-established clinical ophthalmic imaging techniques to achieve more comprehensive anatomic and functional evaluations of the eye based on multiple optical contrasts6,10 . In this work, we integrate PAOM and spectral-domain OCT (SD-OCT) for simultaneously in vivo retinal imaging of rat, where both optical absorption and scattering properties of the retina are revealed. The system configuration, system alignment and imaging acquisition are presented.

Photoacoustic ophthalmology (PAOM), an optical-absorption-based imaging modality, provides the complementary evaluation of the retina to the currently available ophthalmic imaging technologies. We report the using of PAOM integrated with spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) for simultaneous multimodal retinal imaging in rats.

Integrato oftalmoscopia fotoacustico e Spectral-dominio Optical Coherence Tomography

Both the clinical diagnosis and fundamental investigation of major ocular diseases greatly benefit from various non-invasive ophthalmic imaging ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

Wideband rivelatore ottico di ultrasuono per applicazioni Medical Imaging

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticelle per applicazioni di imaging multimodale molecolari

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that implantation of a bone autograft would induce greater bone regeneration by abundant blood vessel formation. To investigate the effect of the graft on neovascularization at the defect site, we developed a micro&#8211;computed tomography (&#181;CT) approach to characterize newly forming blood vessels, which involves systemic perfusion of the animal with a polymerizing contrast agent. This method enables detailed vascular analysis of an organ in its entirety. Additionally, blood perfusion was assessed using fluorescence imaging (FLI) of a blood-borne fluorescent agent. Bone formation was quantified by FLI using a hydroxyapatite-targeted probe and &#181;CT analysis. Stem cell recruitment was monitored by bioluminescence imaging (BLI) of transgenic mice that express luciferase under the control of the osteocalcin promoter. Here we describe and demonstrate preparation of the allograft, calvarial defect surgery, &#181;CT scanning protocols for the neovascularization study and bone formation analysis (including the in vivo perfusion of contrast agent), and the protocol for data analysis.
The 3D high-resolution analysis of vasculature demonstrated significantly greater angiogenesis in animals with implanted autografts, especially with respect to arteriole formation. Accordingly, blood perfusion was significantly higher in the autograft group by the 7th day after surgery. We observed superior bone mineralization and measured greater bone formation in animals that received autografts. Autograft implantation induced resident stem cell recruitment to the graft-host bone suture, where the cells differentiated into bone-forming cells between the 7th and 10th postoperative day. This finding means that enhanced bone formation may be attributed to the augmented vascular feeding that characterizes autograft implantation. The methods depicted may serve as an optimal tool to study bone regeneration in terms of tightly bounded bone formation and neovascularization.

Implantation of autologous and allogeneic bone grafts constitute accepted approaches to treat major craniofacial bone loss. Yet the effect of graft composition on the interplay among neovascularization, cell differentiation and bone formation is unclear. We present a multimodal imaging protocol aimed to elucidate the angiogenesis-osteogenesis interdependence at the graft proximity.

Tomografia Computerizzata e Optical Imaging di osteogenesi-angiogenesi Accoppiamento per valutare l&#39;integrazione di craniche Bone Autoinnesti e Alloinnesti

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Non distruttive monitoraggio dello sviluppo del vaso sanguigno tessutale basati su Scaffold degradabile usando la tomografia a coerenza ottica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Dual Raster-Scanning Photoacoustic Small-Animal Imager for Vascular Visualization

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great potential for application in the imageology of small animals. The wide-field photoacoustic imaging of small animals can provide images with high spatiotemporal resolution, deep penetration, and multiple contrasts. Also, the real-time photoacoustic imaging system is desirable to observe the hemodynamic activities of small-animal vasculature, which can be used to research the dynamic monitoring of small-animal physiological features. Here, a dual-raster-scanning photoacoustic imager is presented, featuring a switchable double-mode imaging function. The wide-field imaging is driven by a two-dimensional motorized translation stage, while the real-time imaging is realized with galvanometers. By setting different parameters and imaging modes, in vivo visualization of small-animal vascular network can be performed. The real-time imaging can be used to observe pulse change and blood flow change of drug-induced, etc. The wide-field imaging can be used to track the growth change of tumor vasculature. These are easy to be adopted in various areas of basic biomedicine research.

A dual raster-scanning photoacoustic imager was designed, which integrated wide-field imaging and real-time imaging.

Doppia scansione Raster Photoacoustic Small-Animal Imager per la visualizzazione vascolare

Imaging of vascular networks on small animals has played an important role in basic biomedical research. Photoacoustic imaging technology has great ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

Valutazioni strutturali in vivo della malattia oculare in modelli di roditori mediante tomografia a coerenza ottica

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...