Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi terapeutici del cancro, come l'identificazione di geni chiave coinvolti nella dipendenza da idrogeno. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza la dipendenza da oncogene che è comune a molti tumori guidati dalla chinasi, quindi è applicabile a più tipi di tumore. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla leucemia, può anche essere applicato ad altri sistemi, come tumori solidi come il cancro ai polmoni, tumori cerebrali e tumori pancreatici.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza in biologia molecolare e fisiologia cellulare. Per iniziare, raccogli le ossa delle gambe da un topo eutanasiato. Pulire i tessuti dalle ossa con un bisturi.
Quindi mettere le ossa in PBS freddo sul ghiaccio e schiacciare le ossa con un pestello. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle da 70 micrometri in un tubo del tappo a vite da 50 millilitri con una pipetta da 10 millilitri. Lavare la malta e il pestello più volte con PBS freddo e aggiungere la sospensione cellulare al tubo da 50 millilitri.
Successivamente centrifugare il midollo osseo e rimuovere il supernatante con pipetta sottovuoto e vetro. Resuspend il pellet cellulare in 5 millilitri di PBS. Utilizzando una pipetta, aggiungere lentamente il midollo osseo sospeso nella parte superiore del poli-saccarosio a temperatura ambiente.
Successivamente, ruotare il poli-saccarosio a 400 G per 20 minuti con il freno spento. Dopo la centrifugazione, raccogli l'interfaccia nuvolosa totale della cella mononucleare con una pipetta e trasferiscila in un nuovo tubo da 15 millilitri. Portare il volume a 10 millilitri con PBS e rimuovere 20 microlitri per il conteggio.
Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e posizionare il pellet sul ghiaccio. Successivamente, resuspend il pellet di cellule in PBS con EDTA e BSA. Aggiungere microperline CD117 alla sospensione cellulare e vortice da mescolare.
Dopo questo, incubare la sospensione per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Quindi portare il volume fino a 10 millilitri con più PBS con EDTA e BSA e centrifugare a 1200 G a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Utilizzare un vuoto per rimuovere il supernatante e sospendere il pellet di cellule in PBS con EDTA e BSA.
Quindi aggiungere 3 millilitri di PBS con EDTA e BSA a un supporto magnetico con una colonna magnetica e consentirgli di fluire in un tubo di raccolta. Al termine del buffer che scorre attraverso la colonna, aggiungere la sospensione della cella e consentirgli di fluire attraverso la colonna nel tubo di raccolta. Aggiungere quindi altri 5 millilitri di PBS con EDTA e BSA alla colonna e sciacquarlo immediatamente con lo stantuffo.
Rimuovere lo stantuffo e ripetere lo scarico prima di contare le celle. Dopo aver centrifugato le cellule, rimuovere il supernatante e sospendere il pellet di cella in IMDM completo per la coltura. Coltura delle cellule durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
In primo luogo, combinare il DNA plasmide retrovirale con il plasmide di imballaggio, il cloruro di calcio e l'acqua in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 500 microlitri di HBS ad un altro tubo da 1,5 millilitri. Aggiungere la miscela di trasfezione per quanto riguarda la goccia al tubo contenente HBS mescolando contemporaneamente con il vortice impostato sull'impostazione più bassa.
Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 20-30 minuti. Durante il periodo di incubazione, aggiungere clorochina alle cellule HEK e tenerle nell'incubatrice. Dopo aver aggiunto il mix di trasfezione, incubare le cellule per 8 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius 5%CO2 cambiando il supporto cellulare aggiungendo 14 millilitri di supporti DMEM10 freschi molto lentamente.
Pipeggiare lentamente contro la parete del piatto aiuta a prevenire qualsiasi stripping delle cellule HEK. Quindi incubare le cellule durante la notte nell'incubatore di CO2 37 gradi Celsius 5%.. Utilizzare una siringa da 10 millilitri per raccogliere il supernatante virale.
Quindi attaccare un filtro siringa da 0,45 micrometri alla siringa. Immergete il supernatante virale in un nuovo tubo di raccolta. Raccogli il supernatante virale circa 16 ore dopo.
Successivamente, aggiungere due millilitri di frammento di fibronectina umana ricombinante in PBS a piastre di coltura di 6 pozzi non trattate. Il giorno successivo, utilizzare una pipetta per rimuovere la fibronectina dalle piastre. Bloccare le piastre con 2%BSA in PBS e incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti.
Utilizzare un vuoto per rimuovere BSA e lavare le piastre con PBS prima di rimuoverlo con un vuoto. Successivamente, aggiungere immediatamente il supernatante virale filtrato e centrifugare la piastra per due ore. Utilizzare un vuoto per rimuovere il supernatante e ruotare di nuovo la piastra.
Successivamente rimuovere il supernatante con un vuoto e lavare i pozzi rivestiti viralmente con PBS. Rimuovere il PBS con un vuoto, aggiungere il c-Kip precedentemente coltivato più le cellule del mouse ai pozzi rivestiti viralmente. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
48 ore dopo la trasduzione, pelletare le cellule tramite centrifugazione e rimornerne nel tampone FACS 1. Prima scongelare la cellulosa metile con citochine per topi a temperatura ambiente. Quindi aliquota 3 millilitri di cellulosa metile in un tubo FACS.
Aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare con gli inibitori appropriati a 3 millilitri di cellulosa metile. Quindi vortice la sospensione in alto per 10-30 secondi. Dopo che la maggior parte delle bolle d'aria fuoriesci, utilizzare una siringa da 1 millilitro per placcare 1 millilitro del supporto in tre piastre replicate.
Mettere i piatti in una grande piastra di Petri insieme a una piastra aperta contenente acqua sterile. Quindi coprire la grande piastra di Petri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Preparare la macchia di cloruro di iodonitrotetrazolo sciogliendo 10 milligrammi del cloruro di iodonitrotetrazolo in 10 millilitri di acqua.
Il filtro sterilizza la soluzione di colorazione con una siringa di blocco Luer dotata di un filtro da 0,2 micrometri. Nella cappa di coltura tissutale, aggiungere 100 microlitri della soluzione di colorazione a goccia intorno alla piastra CFU. Quindi incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura cellulare.
Infine, dopo che le colonie hanno trasformato un colore marrone rosso scuro, usa uno sfondo bianco nel cappuccio sterile per la coltura tissutale per scattare foto della piastra CFU macchiata. In questo protocollo, sono state utilizzate molteplici analisi imparziali dell'espressione genica per identificare la componente genetica che orchestra la dipendenza da oncogene. Per convalidare il ruolo di c-Fos e e Dusp1 come bersaglio terapeutico nella leucemia, la loro sovraespressione è stata confermata con cellule che esprimono l'oncogene BCR-ABL1.
L'analisi tramite RT-qPCR e western blotting ha confermato che entrambi sono stati indotti da BCR-ABL1 e che la loro espressione è aumentata dal fattore di crescita IL-3. YFP più cellule esprimenti sono state ordinate tramite FACS per ulteriori saggi in vitro e in vivo. I risultati hanno dimostrato che la cancellazione di c-Fos e Dusp1 da sola ha inibito i numeri CFU.
Le cellule prive sia di c-Fos che di Dusp1 sono state significativamente compromesse nella loro capacità di formare colonie e il trattamento con Imatinib ha spazzato via tutti i CFC indicando che la perdita di c-Fos e Dusp1 è sinteticamente letale per l'espressione BCR-ABL1. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo del cancro per esplorare le reti genetiche e i geni che guidano la dipendenza da idrogeno e come questi geni influenzano la loro particolare risposta nei modelli di topo e nei pazienti umani. Non dimenticare che lavorare con retrovirus e campioni di pazienti può essere estremamente pericoloso e le pratiche di laboratorio sicure dovrebbero essere osservate durante l'esecuzione di questa procedura.
