La pressione costante all'interno del dispositivo di fissazione mantiene i polmoni in uno stato ragionevolmente gonfiato generando un campione polmonare istologico adatto per valutare l'enfisema indotto dal fumo di sigaretta lieve. Il vantaggio principale di questo modello è che può riparare molti polmoni allo stesso tempo usando la stessa pressione costante senza collasso polmonare o deflazione. A dimostrare la procedura sarà Naoko Arano, uno studente laureato del mio laboratorio.
Dopo aver confermato la mancanza di risposta al movimento riflesso, fai un'incisione nella pelle e nel tessuto muscolare lungo la linea mediale del topo, mirando alla regione cefalica, e taglia lateralmente per creare uno spazio di lavoro più ampio. Dopo aver esposto lo strato diaframma perforare il tessuto con pinza e aprire lo spazio toracico. Tagliare l'area sternale permettendo di visualizzare i polmoni e il cuore.
E tagliare l'atrio sinistro e il ventricolo destro. Inserire una cannula calibro 24 collegata a una pompa perfusione nella zona del ventricolo destro e dirigere la cannula verso l'area cefalica fino a raggiungere l'arteria polmonare. Quindi, accendere la pompa e perfondere il tessuto con circa 200 millilitri di PBS per un'ora fino a quando tutto il tessuto polmonare non è cambiato in un colore bianco.
Alla fine della perfusione tagliare il tessuto connettivo che circonda la trachea, i polmoni e il cuore, e utilizzare una sutura per legare il bronco principale destro. Successivamente, raccogliere tutti i singoli lobi del polmone destro e posizionare il cuore e i lobi del polmone sinistro in singole siringhe da 10 millilitri contenenti un appropriato fissatore. Ritrarre lo stantuffo creando un vuoto nella siringa per gonfiare i polmoni e rimuovere il polmone dalla siringa.
Inserire una cannula calibro 20 nella trachea e utilizzare una sutura per fissare la cannula in posizione. Collegare una siringa millilitro riempita con fissante alla cannula e riempire il polmone con un fissatore aggiuntivo per verificare la presenza di perdite. Assicurarsi che il sito di inserimento sia stato fissato per evitare che il campione polmonare si distacci dalla scheda polmonare durante la fissazione.
Quindi trasferire il tessuto all'apparecchiatura di pressione di fissazione polmonare, rimuovendo il campione e legando la trachea con un nodo alla fine del periodo di fissazione. Il componente inferiore dell'apparecchiatura di pressione di fissazione polmonare in cui viene inserito il campione polmonare è collegato tramite cannula calibro 20 alla punta del flusso di formalina con un fermafo a tre vie. La pressione viene generata dai diversi livelli superficiali del fissatore tra i compartimenti inferiore e superiore.
La differenza di pressione è di 25 centimetri d'acqua, ma la manopola di regolazione dell'altezza può essere utilizzata per regolare la pressione tra 25 e 30 centimetri di acqua. Una pompa collega i contenitori inferiore e superiore, preservando una differenza di 25 centimetri nell'altezza fissa della superficie, e dirige il flusso dell'agente. Dopo 48 ore di fissazione i polmoni dei topi knockout SMP30 esposti all'aria ambiente non mostrano un marcato allargamento dello spazio aereo.
Significativi allargamenti dello spazio aereo e distruzione delle pareti alveolari, tuttavia, si osservano nei topi knockout SMP30 esposti al fumo di sigaretta cronico. Inoltre, l'intercetta lineare media e l'indice distruttivo dei campioni polmonari sono significativamente maggiori nei topi knockout SMP30 esposti al fumo rispetto agli animali esposti all'aria. Il nostro laboratorio utilizza il 10% di formalina, ma i ricercatori possono utilizzare altri agenti di fissazione in base alle loro esigenze sperimentali.
Come abbiamo riferito utilizzando il sistema di fissazione dimostrato, i campioni polmonari possono essere raccolti da vari modelli di enfisema del topo per la loro valutazione morfometrica. Poiché gli agenti di fissaggio possono essere pericolosi, indossare sempre i dispositivi di protezione del personale appropriati e lavorare in una stanza ben ventilata.
