Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della farmacologia della sicurezza cardiaca. Ad esempio, una nuova medicina umana ha il rischio di modificare il normale ritmo cardiaco? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può valutare un gran numero di composti rapidamente e a un costo moderato.
A dimostrare la procedura sarà Camille Forny, ricercatrice associata nel mio laboratorio. Per prepararsi alla misurazione delle contrazioni della sizizia dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo, o HIPSCCM, iniziare posizionando CryoTube contenenti cellule congelate in un bagno d'acqua Celsius di 37 gradi per due minuti. Trasferire l'intera sospensione cellulare scongelata da ogni tubo a un unico tubo conico fresco da 50 millilitri.
Per recuperare le celle rimanenti, lavare ogni tubo con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo di placcatura prebellico e aggiungere questo mezzo al tubo conico da 50 millilitri contenente celle scongelate. Aggiungere otto millilitri di mezzo di placcatura caldo al tubo e mescolare con cura le sospensioni. Utilizzare il metodo di esclusione blu tripano e un emocitometro per contare le cellule vive.
Aggiungendo un mezzo di placcatura caldo, regolare la concentrazione a 50.000 cellule per millilitro. Per distribuire le cellule in due nuove piastre di coltura cellulare da 384 po ', aggiungere 25 microlitri a ciascun pozzo, che produrranno circa 12.500 cellule per pozzo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in piastre da 384 po 'in atmosfera umidificata con 5% di anidride carbonica per un totale di tre o quattro settimane.
Il giorno seguente, sostituire il mezzo di placcatura con 50 microlitri di mezzo di manutenzione calda. Successivamente, sostituire metà del mezzo di manutenzione ogni due o tre giorni. Nei giorni sette, 14 e 21, sostituire completamente il mezzo.
Una volta che le cellule sono state mantenute in coltura per tre o quattro settimane, si sono formate spontaneamente contraendo la sincitia e l'effetto dei composti su queste contrazioni può essere misurato. Il giorno del saggio, almeno due ore prima che la prima piastra cellulare venga posizionata all'interno del lettore di piastre per la misurazione, accendere il lettore e impostare l'impianto di riscaldamento a 37 gradi Celsius. Per preparare le piastre composte, scaldare a temperatura ambiente 40 millilitri di mezzo di manutenzione integrati con streptomicina penicillina volume per volume dell'1%.
Mentre il mezzo si sta riscaldando, distribuire i composti di prova e i controlli in due piastre composte da 384 po 'aggiungendo 1,5 microlitri di soluzione di magazzino per pozzo. Centrifugare le piastre composte a 100 G per un minuto. Aggiungere 37 microlitri di mezzo di manutenzione per ogni pozzo e centrifugare nuovamente le piastre a 100 G per un minuto.
Per preparare il colorante fluorescente, riscaldare 100 millilitri di mezzo di manutenzione integrati con streptomicina penicillina dell'1% volume per volume in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 10 millilitri del mezzo riscaldato al mix di colorante fluorescente sensibile al calcio e quencher per ricostituirli come mezzo di fluorescenza di serie. Avviare il software lettore di lastre.
Preparare il software per registrare un segmento di due minuti di onde di calcio con una frequenza di acquisizione di almeno 10 hertz. Per rendere il mezzo di fluorescenza per ogni piastra cellulare, diluire tre millilitri di mezzo di fluorescenza stock con 12 millilitri di mezzo di mantenimento caldo con antibiotici. Sostituire 20 microlitri di mezzo in ogni pozzo della piastra cellulare con 30 microlitri di mezzo di fluorescenza e mescolare tubazione su e giù una volta.
Subito dopo, posizionare la piastra in un lettore di lastre per consentire agli HIPSCCM di adattarsi alla temperatura del lettore per 60 minuti. Quindi, avviare il software di lettura delle lastre. Registrare un segmento di due minuti di onde di calcio con una frequenza di acquisizione di almeno 10 hertz per definire il tasso di battitura di base per ogni pozzo.
È importante assicurarsi che la piastra cellulare non venga trasferita fuori dal dispositivo dopo l'acquisizione dei dati. Con alcune versioni del software, è necessario interrompere la registrazione prima che finisca completamente. Utilizzare il robot lettore di lastre per pipettare cinque microlitri dei composti di prova e di riferimento bene a bene dalla piastra composta nella piastra cellulare.
Successivamente, inizia l'acquisizione dei dati nel software di lettura delle lastre per registrare due segmenti minuti di onde di calcio a partire da cinque, 15, 30, 45 e 60 minuti dopo l'aggiunta composta. Per avviare l'analisi dei dati, esportare i dati grezzi per ogni periodo di registrazione dal software di lettura delle lastre nei file di testo ASCII. E poi importarli nel software di analisi dei dati.
Dal software di analisi dei dati esportare le frequenze di battiaggio primarie per ogni periodo di registrazione come copie degli Appunti. Estrarre la frequenza di battimento primaria per ogni pozzo e ogni punto di tempo. Infine, importare le frequenze di battimento in un software per fogli di calcolo incollando gli Appunti e continuare l'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.
La registrazione delle onde di calcio al basale su una piastra da 384 po 'mostra che nella maggior parte dei casi tutti i pozzi rivelano un tasso di battiaggio regolare con poca variabilità attraverso la piastra. Quando vengono aggiunti bloccanti dei canali ionici cardiaci, influenzano il ritmo dei cardiomiociti. L'amlodipina, un bloccante dei canali lenti del calcio, accelera il ritmo di oltre il 100% in modo dipendente dalla concentrazione fino a un micromolare.
E soprattutto, amlodipina arresta il pestaggio. E-4031, un bloccante dei canali di potassio del raddrizzatore rapido ritardato decelera il ritmo di circa il 65-70% in modo dipendente dalla concentrazione fino a 10 micromolari. La tetrodotossina, un bloccante dei canali veloci del sodio decelera il ritmo di circa il 15% in modo dipendente dalla concentrazione fino a uno a 30 micromolari, mentre sopra i 30 micromolari, la tetrodotossina arresta il pestaggio entro i primi cinque minuti.
Bepridil, un blocco misto di canali cardiaci di sodio, calcio e potassio produce anche un effetto tutto o niente, suggerendo che il blocco del canale del sodio è l'azione primaria del bepridil. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere estremamente delicati quando si pipetta nella piastra di coltura cellulare. Questi tessuti sono molto fragili e facilmente danneggiati se toccati da pipette.
Non dimenticare che lavorare con cellule umane e farmaci attivi può essere pericoloso e precauzioni come indossare guanti e occhiali di sicurezza dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
