La valutazione della sicurezza cardiaca è una componente cruciale durante il processo di sviluppo del farmaco. I cardiomiociti umani derivati da iPSC hanno dimostrato di essere un modello affidabile, efficiente e basato sull'uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca. Abbiamo stabilito metodologie per studiare in modo completo le caratteristiche funzionali dei cardiomiociti umani derivati da iPSC, che sono di modellazione della malattia davvero importanti, screening della tossicità cardio indotta da farmaci e medicina di precisione.
La crescente incorporazione di cardiomiociti derivati da iPSC umani nel processo standard di valutazione della sicurezza preclinica ha il potenziale per migliorare l'accuratezza della previsione della tossicità dei composti di un candidato. Inizia coltivando i cardiomiociti derivati da iPSC umani per almeno 10 giorni prima di effettuare la misurazione. Accendere il regolatore di temperatura e impostarlo a 37 gradi Celsius.
Accendere il microscopio, la fotocamera e l'alimentazione di anidride carbonica. Riempire la camicia d'acqua del portapiastre con una quantità appropriata di acqua deionizzata sterile. Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul portapiastre e incubare le cellule per almeno cinque minuti.
Apri il software di visualizzazione, quindi imposta la frequenza fotogrammi della videocamera su 75 fotogrammi al secondo e la risoluzione del video o dell'immagine su 1024 x 1024 pixel. Applica le funzioni di messa a fuoco automatica e luminosità automatica, registra video e immagini di cardiomiociti derivati da iPSC umani. Posizionare con cautela una goccia da otto microlitri di soluzione di rivestimento a matrice extracellulare sull'area dell'elettrodo di registrazione di ciascun pozzetto delle piastre array di microelettrodi a 48 pozzetti.
Quindi aggiungere tre millilitri di acqua deionizzata sterile all'area circostante i pozzetti per prevenire l'evaporazione della soluzione di rivestimento. Utilizzando una punta di pipetta da 200 microlitri, rimuovere la maggior parte del mezzo della matrice extracellulare dalla superficie del pozzo all'interno della stessa singola fila o colonna senza toccare gli elettrodi. Seminare 50.000 cellule per pozzetto in una goccia da otto microlitri di mezzo di semina sopra l'area dell'elettrodo di registrazione.
Ripetere fino a quando tutti i pozzetti sono stati placcati con cellule. Quindi incubare le piastre dell'array di microelettrodi in un incubatore di colture cellulari umidificato. Aggiungere lentamente 150 microlitri di terreno di semina a ciascun pozzetto delle piastre dell'array di microelettrodi.
Il giorno 10 dopo la placcatura, controllare al microscopio la densità del monostrato di iPSC CM umano che batte spontaneamente. Posizionare la piastra dell'array di microelettrodi a 48 pozzetti nello strumento di registrazione. Assicurarsi che la temperatura sia di 37 gradi Celsius e che l'anidride carbonica sia del 5%Aprire il software del navigatore.
Nella finestra di configurazione sperimentale, selezionare la configurazione cardiaca in tempo reale e le registrazioni del potenziale sul campo. Applicare configurazioni di battitura spontanee o incollate. Nei parametri di rilevamento dei battiti, impostare la soglia di rilevamento su 300 micro volt, il periodo minimo di battimento su 250 millisecondi e il periodo massimo di battimento su cinque secondi.
Selezionare la regressione polinomiale per il calcolo della durata potenziale del campo. Controllare se il segnale di attività elettrica basale è maturo e stabile e acquisire le attività cardiache di base per uno o tre minuti. Eseguire la registrazione 10 giorni dopo la placcatura.
Sostituire il mezzo di mantenimento iPSC CM umano con la soluzione di tirodo e lasciare che le cellule si acclimatino per 15 minuti. Inserire i sensori di temperatura nella camera e inserire il piatto da 35 millimetri all'interno. Regolare la temperatura a 37 gradi Celsius.
Estrarre le micro pipette dai capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di micro pipette. Riempire le micro pipette con la soluzione intracellulare e inserirle nel supporto collegato allo stadio principale dell'amplificatore patch clamp . Aprire il software di acquisizione, caricare il protocollo di registrazione del potenziale di azione e selezionare la configurazione del morsetto di tensione.
Inserire la micropipetta nella soluzione da bagno e selezionare i singoli CM iPSC umani appropriati. Regolare e abbassare la posizione della micropipetta accanto alla cella selezionata utilizzando un micromanipolatore. Quando la punta della pipetta viene inserita nella soluzione del bagno, verificare la resistenza della pipetta sul monitor dell'oscilloscopio.
Posizionare la pipetta vicino alla cella e gli impulsi di corrente diminuiranno leggermente per riflettere la crescente resistenza della tenuta. Applicare un'aspirazione delicata con pressione negativa per aumentare la resistenza. Questo formerà un gigaseal.
Quindi applicare la funzione di tenuta. Applicare un'aspirazione aggiuntiva per rompere la membrana e ottenere una configurazione di registrazione dell'intera cella. A questo punto, passare dalla modalità morsetto di tensione alla modalità di morsetto di corrente o nessuna iniezione di corrente utilizzando la finestra di dialogo dell'amplificatore.
Premere il pulsante di registrazione per generare e salvare i file di registrazione del potenziale di azione. Eseguire la misurazione del calcio transitorio almeno 10 giorni dopo la placcatura. Preparare la soluzione di tirodo fresco e la soluzione di carico Fura-2 AM.
Aspirare il mezzo di manutenzione iPSC CM umano e lavare due volte le camere con la soluzione di tyrode. Applicare 100 microlitri di soluzione di carico Fura-2 AM e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Sostituire la soluzione di carico Fura-2 AM con la soluzione di tirodo e incubare per almeno cinque minuti per la completa deesterificazione di Fura-2 AM. Aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo di immersione in olio 40x di un microscopio a epifluorescenza invertita.
Posizionare la camera cellulare nell'adattatore scenico del microscopio. Installare i fili del regolatore di temperatura nella camera da bagno e impostarlo su 37 gradi Celsius. Installare gli elettrodi di stimolazione del campo elettrico e impostare gli impulsi a 0,5 hertz con una durata di 20 millisecondi.
Accendere la sorgente luminosa di commutazione a lunghezza d'onda ad altissima velocità e impostarla sulla modalità di commutazione rapida a 340 nanometri e 380 nanometri. Applicare un tempo di esposizione di 20 millisecondi per entrambe le lunghezze d'onda e un tempo di registrazione di 20 secondi. Registra il video che riflette i cambiamenti in tempo reale dei transitori di calcio, esporta i dati in un foglio di calcolo per l'analisi.
Per la misurazione del movimento di contrazione è stato utilizzato cardiomiociti monostrato derivati da iPSC umani. L'analisi di una traccia del movimento di rilassamento della contrazione utilizzando il software dell'analizzatore ha rilevato l'inizio delle contrazioni, il picco di contrazione, la fine della contrazione, il picco di rilassamento e la fine del rilassamento. Su tutti gli elettrodi all'interno delle piastre dell'array di microelettrodi è stata osservata una copertura completa del monostrato di cardiomiociti derivati da iPSC umani.
Le forme d'onda mature registrate da ciascun elettrodo riflettevano il potenziale del campo cardiaco con caratteristiche identificabili. Dopo l'analisi, sono stati ottenuti il periodo di battuta, la durata del potenziale del campo e l'ampiezza del picco. Le registrazioni del patch clamp dell'intera cellula in modalità di bloccaggio corrente hanno registrato i potenziali d'azione spontanei dei singoli cardiomiociti.
Dopo l'analisi, sono stati ottenuti diversi parametri, tra cui l'ampiezza, il potenziale diastolico massimo e la durata del potenziale d'azione. Dopo l'analisi dell'imaging del calcio, è stato ottenuto il rapporto F340 per F380 nel tempo e sono state tracciate tracce grezze di transitori di calcio stimolati. Inoltre, sono stati ottenuti parametri come l'ampiezza, il calcio diastolico e la tau di decadimento del calcio.
È importante utilizzare cardiomiociti umani derivati da iPSC che sono in buone condizioni di battitura, nonché garantire l'elevata purezza dei cardiomiociti derivati da iPSC umani. Questo protocollo include quattro tecniche specifiche per studiare la funzionalità dei cardiomiociti derivati da iPSC umane, altre configurazioni o automatico se studiare le correnti ioniche cardiache che svolgono un ruolo cruciale nel cuore
