Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle infezioni epatotropiche e nei campi delle malattie del fegato. Come il contributo delle popolazioni cellulari residenti nel fegato, alla patogenesi virale, alla cinetica longitudinale delle infezioni, ai meccanismi di replicazione virale, all'invasione immunitaria, in un sistema di modelli fisiologici e studi di test farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di ricapitolare un microambiente epatico.
Che può essere mantenuto per lunghi periodi di tempo ed è naturalmente suscettibile all'infezione da epatite B a livelli fisiologici rilevanti. Questo è stato in precedenza un vincolo fondamentale nel campo dell'epatite B. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia o la diagnosi dell'infezione da HBV perché gli studi di test farmacologici possono essere eseguiti in una piattaforma fisiologica per durate prolungate.
Ciò consente la valutazione dei trattamenti sequenziali dei farmaci insieme all'analisi dell'efficacia delle strategie di trattamento esistenti e nuove. Questo metodo può fornire comprensione nell'epatite B e può anche essere applicato ad altri studi di malattia, tra cui altre infezioni epatotrope, malattie del fegato o studi sul metabolismo dei farmaci. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché richiede attenzione a particolari dettagli per consentire il successo del mantenimento del tessuto epatico per lunghi periodi di tempo.
E anche la familiarizzazione con gli strumenti e le attrezzature specializzate. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Compreso il montaggio delle piastre, nonché lo scongelamento e la semina delle cellule.
Poiché i passaggi coinvolti nella coltura a lungo termine delle cellule derivate dal fegato sono impegnativi quando si utilizza un nuovo sistema di coltura. In primo luogo, accendere sia il compressore che la pompa per vuoto associata alla piattaforma di chip epatici. Procedere a un armadio per tubi di vetro per assemblare ed equilibrare le piastre.
Posizionare una membrana sterile sulla base della piastra per iniziare a assemblare aseticamente le piastre microfluidiche. Assicurarsi che la membrana sterile poggia senza intoppi sui due perni della piastra di base. Quindi aggiungere la piastra superiore ben contenente.
Aggiungere un coperchio sterile della piastra. E utilizzare una coppia di precisione automatizzata, impostata su 33 libbre. Utilizzo di una sequenza di serraggio a spirale per stringere le viti alla base della piastra.
Utilizzando una coppia manuale, assicurarsi che tutte le viti siano serrate a 35 libbre. Successivamente, pre-riscaldare il mezzo di semina dell'epatocita fino a 37 gradi Celsius prima dell'adescamento. Posizionare la piastra completamente assemblata nella banchina di lavaggio.
E assicurati che la piastra si agganci completamente. Aggiungere 400 microlitri di mezzo di semina epatocita sul lato del serbatoio di ogni pozzo per innescare la piastra. Successivamente, avviare il flusso verso l'alto per 3,5 minuti a un microlitro al secondo.
Gli indicatori rossi sul lato della piastra indicheranno se la circolazione microfluidica funziona correttamente. Una volta che il mezzo è pompato sul lato di crescita cellulare della piastra, aggiungere altri 1,2 millilitri di mezzo di semina epatocita. Trasferire con cura la piastra nell'alloggiamento di entrata all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2.
Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 16 ore. Successivamente, trasferire la piastra in un molo di lavaggio. Pipettare delicatamente su e giù per eliminare eventuali bolle.
Utilizzando una forcep sterile, aggiungere una carta filtrante rotonda sterile ad ogni pozzo. Quindi aggiungere un'impalcatura di attacco cella e un anello di fissaggio a ciascun pozzo. Utilizzare uno stantuffo sterile per spingere verso il basso ogni pozzo e bloccare gli anelli di contenimento e le impalcature in posizione.
Quindi, aspira tutto il mezzo. E aggiungere delicatamente 400 microlitri di mezzo di semina epatocito pre-riscaldato sopra l'impalcatura. Avviare il flusso in direzione verso il basso a un microlitro al secondo per 3 minuti e mezzo.
Aspirare tutto il mezzo pompato fuori dal lato del serbatoio della piastra. Aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di semina epatocita ad ogni bene. Quindi riportare la piastra sul dock per portare il volume totale per pozzo fino a 1,6 millilitri.
In primo luogo, pre-riscaldare il mezzo di scongelamento dell'epatocita e il mezzo di semina degli epatociti fino a 37 gradi Celsius. Successivamente, scongelare una fiala di epatociti umani primari secondo le istruzioni del fornitore. In un armadio a tubo di vetro, rimospendare le cellule in un millilitro di mezzo di semina epatocita.
Quindi posizionare le cellule rimorsi su ghiaccio. Utilizzando trypan blue, contare le celle per assicurarsi che la vitalità delle celle sia superiore al 90%Trasferire la piastra completamente assemblata sul banco di lavaggio. E aspirare tutto il mezzo dai pozzi.
Recuperate le cellule dal ghiaccio e aggiungete 600.000 epatociti ad ogni pozzo in un volume di 500 microliter di mezzo di semina degli epatociti. Avviare il flusso verso il basso ad una portata di un microliter al secondo. Aggiungere 900 microlitri di mezzo di semina epatocita ad ogni pozzo per portare il volume totale in ciascuno a 1,6 millilitri.
Trasferire la piastra all'alloggiamento di applicazione all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e con 5%CO2. Avviare il flusso verso il basso ad una portata di un microlitro al secondo per otto ore. Successivamente, invertire il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per otto ore.
Quindi trasferire la piastra sul banco di lavaggio e aspirare tutto il mezzo dai pozzi. Aggiungere 400 microlitri di mezzo di manutenzione degli epatociti ad ogni pozzo. E avviare il flusso nella direzione verso il basso ad una portata di un microlitro al secondo per 3 minuti e mezzo.
Successivamente, aspirare tutto il mezzo dal serbatoio e aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di manutenzione degli epatociti. Trasferire la piastra nell'alloggiamento di entrata all'interno di un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 48 ore.
Dopo 48 ore, lavare la piastra trasferendola al banco di lavaggio. Aspirare tutto il mezzo dai pozzi. E aggiungere 400 microlitri di mezzo di manutenzione.
E avviare il flusso nella direzione verso il basso a un microlitro al secondo per 3,5 minuti. Quindi aspirare tutto il mezzo che appare nel lato del serbatoio dei pozzi. Aggiungere 1,4 millilitri di mezzo di manutenzione degli epatociti.
Quindi trasferire la piastra di nuovo alla docking station nell'incubatore umidificato. Avviare il flusso verso l'alto ad una portata di un microlitro al secondo per 48 ore. Sostituire il mezzo utilizzando questo processo di lavaggio e sostituzione ogni 48 ore.
Gli epatociti umani primari sono solitamente stabili solo per un periodo di tempo limitato quando si utilizzano sistemi di coltura convenzionali. Tuttavia, utilizzando il protocollo qui descritto, possono essere mantenuti funzionalmente per lunghi periodi di tempo. L'albumina umana è secreta da epatociti funzionali ed è considerata il miglior marcatore per valutare la funzionalità epatica.
L'albumina è vista come stabilmente e altamente espressa dalle culture 3D fino almeno al giorno 40 dopo il seeding. Per le co-colture, la funzionalità e la vitalità delle cellule di Kupffer vengono valutate misurando la secrezione di citochine specifiche. Come si vede qui, i livelli misurati di IL-6 e TNF alfa indicano che le cellule sono state mantenute funzionalmente e vitali.
Oltre a mantenere il loro fisiologico metabolismo cellulare, queste colture sono diventate eccezionalmente suscettibili all'infezione da HBV. Il DNA HBV e altri marcatori virali sono facilmente rilevabili dal secondo giorno dopo l'infezione. Mentre le colture convenzionali richiedono l'inoculazione con almeno 500 equivalenti di genoma HBV integrati con DMSO e PEG, queste colture 3D sono infettate da appena 05 equivalenti di genoma non sommentati.
Oltre ai marcatori secreti di infezione virale, da queste colture vengono recuperate impalcature contenenti epatociti. La microscopia ad immunofluorescenza rivela che queste impalcature contengono antigeni virali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di essere gentili quando si maneggiano gli epatociti prima della semina per evitare la morte cellulare.
Inoltre, è essenziale assicurarsi che le piastre siano assemblate correttamente e che tutti i canali di flusso consentano una corretta circolazione dei supporti prima di seminare gli epatociti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunofluorescenza per rispondere a domande aggiuntive. Compresa la posizione e la frequenza delle cellule infette all'interno del tessuto.
Lo stato fisiologico degli epatociti può anche essere valutato mediante colorazione per albumina o strutture epatiche tra cui la proteina di giunzione stretta ZO-1. Dopo questo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della virologia per esplorare l'infezione da epatite B e le risposte immunitarie in un sistema fisiologico modello 3D. Non dimenticare che lavorare con il virus dell'epatite B può essere pericoloso e precauzioni come la vaccinazione precedente, l'uso di DPI appropriati e lavorare secondo adeguate linee guida sulla biosicurezza dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
