La ricerca sul virus dell'epatite E è stata ostacolata dalla mancanza di un efficiente sistema di coltura cellulare. Le nostre tecniche superano questi limiti aprendo la strada alla progettazione di farmaci e allo sviluppo di vaccini. Con questo protocollo, siamo in grado di produrre virus infettivi ad alto formicolio di particelle HEV non avvolte e avvolte, facilitando l'infezione di una varietà di cellule.
L'esecuzione di questo protocollo richiede l'accesso a una struttura BSA-2 e l'esperienza con le tecniche di coltura cellulare di base. Per linearizzare il DNA plasmide, mescolare 10 microgrammi del DNA template con 10 microlitri di tampone e due microlitri dell'enzima di restrizione Micrococcus luteus e regolare il volume finale a 100 microlitri con acqua. Quindi incubare la soluzione per un'ora a 37 gradi Celsius e confermare la linearizzazione del plasmide mediante elettroforesi del gel di agarosio secondo protocolli standard.
Dopo l'isolamento e la linearizzazione del DNA plasmide, il successo della linearizzazione può essere verificato confrontando il DNA plasmide non digerito con il DNA plasmide digerito per elettroforesi gel. Per la trascrizione in vitro del DNA del virus dell'epatite E purificato e a figura intera, mescolare due microgrammi del modello di DNA linearizzato con i reagenti appropriati e utilizzare acqua priva di nucleo per portare il volume finale della soluzione a 100 microlitri. Dopo un'accurata miscelazione, incubare la soluzione per due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo due ore, aggiungere altri due microlitri di T7 RNA polimerasi al tubo. Quindi mescolare la reazione e incubare il tubo a 37 gradi Celsius per altre due ore. Alla fine dell'incubazione, digerire il modello di DNA iniziale con 7,5 microlitri di DNA con miscelazione approfondita e incubare per 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo l'estrazione, controllare attentamente l'integrità e la resa dell'RNA mediante elettroforesi del gel di agarosio secondo protocolli standard. Nel caso di bassa abundancy RNA, si dovrebbero osservare bande distinte, piuttosto che uno striscio sfocato. Alcuni passaggi richiedono un'esecuzione rapida e quindi una preparazione approfondita.
Inoltre, prestare particolare attenzione all'integrità dell'RNA e alla vitalità cellulare. Per preparare le cellule tumorali del fegato umano per la produzione di virus dell'epatite E derivata dalla coltura cellulare, seminare le cellule in 20 millilitri di DMEM completo su un piatto di coltura rivestito di collagene di 15 centimetri e incubare a 37 gradi Celsius fino a raggiungere il 90% di confluenza. Alla fine della coltura, lavare le cellule con 10 millilitri di PBS prima di staccarle dalla piastra di coltura cellulare con tre millilitri dello 0,05%Trypsin-EDTA a 37 gradi Celsius.
Rimospendare le cellule staccate in 10 millilitri di DMEM completo e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri per il conteggio. Trasferire cinque volte 10 alle sei celle in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavare le celle due volte con 35 millilitri di PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, posizionare le cellule sul ghiaccio senza rimuovere il supernatante.
Per l'elettroporazione delle cellule bersaglio, integrare 384 microlitri di citomix con due ATP millimolare e cinque glutationi millimolari, successivamente conservare sul ghiaccio fino a un ulteriore utilizzo. Sostituire con cura il supernatante con tutti i 400 microlitri di soluzione. Aggiungere cinque microgrammi di RNA genomico virale purificato alle cellule e trasferire la sospensione cellulare in una cuvetta di quattro millimetri per l'elettroporazione a 975 microfarad e 270 volt per 20 millisecondi.
Dopo l'elettroporazione, utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cellule il più rapidamente possibile in 11 millilitri di DMEM completo e seminare 10 millilitri delle cellule elettroporate in un piatto di coltura di 10 centimetri rivestito di collagene. Successivamente, aggiungere 1,3 per 10 alla quinta cella in 300 microlitri di mezzo uniformemente su un coperchio scivolare in un pozzo di una piastra da 24 microtiter rivestita di collagene e posizionare la piastra e il piatto nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire il supernatante nel piatto con 10 millilitri di DMEM fresco e restituire il piatto all'incubatore di coltura cellulare per altri sei giorni.
Il quinto e settimo giorno, a seconda della densità cellulare, eseguire la colorazione immunofluorescente del controllo della trasfezione per consentire il calcolo del numero di cellule che esprimono la proteina bersaglio di interesse normalizzata al numero totale di cellule. L'elettroporazione riuscita può essere monitorata mediante colorazione immunofluorescente del controllo della trasfezione. L'efficienza di trasfezione deve superare il 40%Un mutante carente di replicazione può servire come controllo negativo per confermare la specificità della colorazione.
Per raccogliere particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare, il sesto giorno, filtrare il supernatante attraverso una rete da 0,45 microliter per rimuovere eventuali detriti cellulari e conservare il virus dell'epatite E derivato dalla coltura cellulare extracellulare raccolto a quattro gradi Celsius. Per la raccolta di particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare, lavare le cellule con PBS e staccare le cellule con 1,5 millilitri dello 0,05%Tripside-EDTA a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono staccate, interrompere la reazione con 8,5 millilitri di DMEM e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri per la centrifugazione.
Aggiungere 1,6 millilitri di mezzo completo DMEM per elettroporazione a singoli due tubi di reazione millilitro e utilizzare 800 microlitri del mezzo per rimescolare le celle, trasferendo così le cellule ai tubi. Congelare le cellule in azoto liquido e successivamente scongelare le cellule sul ghiaccio tre volte prima che l'alta velocità centrifughi i lisati risultanti per 10 minuti a 10.000 volte g. Quindi trasferire i supernatanti in nuovi tubi senza disturbare i pellet di detriti cellulari per uno stoccaggio di meno 80 gradi Celsius.
Per valutare i titoli delle scorte di virus dell'epatite E intra ed extracellulare di nuova produzione, seminare due volte 10 alle quattro cellule per 100 microlitri di MEM per pozzo nei 60 pozzi centrale di una piastra microtitere a 96 possiedi rivestita di collagene e riempire i pozzi più esterni con 100 microlitri di PBS per pozzo. Dopo 24 ore a 37 gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri di supernatante di particelle del virus extracellulare alla prima fila di cellule. Dopo aver accuratamente miscelato, diluire in serie il contenuto del pozzo sei volte a una concentrazione da uno a tre per pozzo trasferendo 50 microlitri di supernatante dalla riga precedente a quella successiva di cellule in duplicato fino all'ultima riga di cellule.
Per infettare le cellule con particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare, aggiungere 25 microlitri del supernatante di particelle del virus intracellulare alla riga superiore delle cellule e mescolare ben prima di diluire serialmente le cellule sei volte a un rapporto uno-cinque con 25 microlitri di diluizione in duplicato come dimostrato. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per sette giorni prima della colorazione immunofluorescente secondo il protocollo nel manoscritto. Dopo l'incubazione e la colorazione immunitaria, le piastre possono essere analizzate utilizzando la microscopia ad immunofluorescenza.
Dopo aver immunosottento il ttare finale delle particelle intra ed extracellulari può essere calcolato utilizzando la formula appropriata come indicato. Dopo l'infezione cellulare bersaglio con particelle del virus E derivate dalla coltura cellulare per diluizione seriale, ci si può aspettare che dalle colture cellulari infettate dalle particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare intracellulare non avvolte si possano aspettare tiche di formatura a fuoco per millilitro. Nelle colture infettate da particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare avvolte, sono previsti formicolii tra uno per 10 e il secondo e uno per 10 alla quarta unità di formazione di messa a fuoco per millilitro.
Inoltre, il rapporto tra le copie del genoma e le particelle di virus infettivi intracellulari non avvolte è tipicamente inferiore a quello osservato per le colture infettate da particelle del virus dell'epatite E derivate dalla coltura cellulare extracellulare, suggerendo una maggiore infettività specifica delle specie di virus dell'epatite E non avvolte. La produzione di particelle virali e l'infezione cellulare bersaglio richiedono un ciclo di vita virale completo e possono fornire nuove informazioni sulle interazioni virus-ospite. Questo protocollo può essere modificato per eseguire cinetica di replicazione o per produrre particelle che possono essere utilizzate nei test di infezione.
La maggior parte delle nostre ricerche attualmente dipende da particelle infettive, sia nell'HEV avvolto che in quello non avvolto. E articoli che utilizzano le nostre tecniche sono attualmente in fase di pubblicazione.
