Questo protocollo è progettato per verificare se un candidato composto anti HBV inibisce l'ingresso virale soprattutto bloccando il legame NTCP. Questa tecnica ha lo scopo di indagare se l'ingresso dell'HBV o una fase iniziale dell'infezione potrebbero essere interrotti da qualsiasi composto candidato. A dimostrare la procedura sarà Piyanoot Thongsri, uno studente PSP del mio laboratorio.
Per iniziare la misurazione del polipeptide co-trasportatore del taurocolato di sodio, o NTCP, incubare gli epatociti maturi con otto o più acido etilendiamminotetraacetico o EDTA per 15 minuti. Raccogliere pellet cellulari e fissare gli epatociti aggiungendo 300 microlitri di paraformaldeide al 3,7% in PBS per 15 minuti. Quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri per centrifugarli a 300 G e 25 gradi Celsius per 10 minuti.
Lavare le cellule due volte utilizzando 700 microlitri di PBS contenente siero bovino fetale all'1% o FBS in centrifuga per 10 minuti come descritto in precedenza. Quindi permeabilizzare le cellule con 300 microlitri di 0,05% Triton X 100 in PBS a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo la centrifugazione somministrare tre lavaggi di un minuto ciascuno utilizzando 700 microlitri di PBS contenente l'1% di FBS.
Incubare le cellule per 30 minuti a quattro gradi Celsius con l'anticorpo primario contro NTCP in un rapporto di uno a 100, seguito da tre lavaggi con tampone di lavaggio permanente e centrifugazione. Colorare le cellule con un anticorpo secondario coniugato ad Alexa Fluor 488 per 30 minuti a quattro gradi Celsius e ripetere tre lavaggi di tampone di lavaggio permanente per un minuto ciascuno. Dopo centrifugazione a 300 G, risospendere il pellet cellulare con 200 microlitri di PBS contenente 1% FBS.
Nel software, selezionare i parametri di misurazione per l'analisi citometrica a flusso, tra cui FSC, SSC, FITC o PE. Imposta la regolazione automatica della compensazione e includi i controlli di compensazione come spiegato nel manoscritto. Quindi, eseguire il campione non colorato con una portata fluidica media di 60 microlitri al minuto. Regolare la soglia di dispersione diretta e di dispersione laterale fino a coprire la popolazione cellulare di interesse.
Contrassegnare la regione del cancello in quest'area e applicarla a tutti i controlli di compensazione. Impostare il tubo moltiplicatore fotografico o la fluorescenza PMT utilizzando il controllo non colorato e regolare la tensione PMT di FITC o PE nel quadrante negativo. Eseguire il campione colorato positivo e regolare FITC o PE nella scala del quadrante positivo.
Eseguire i controlli non macchiati, FITC o PE, calcolare la compensazione e applicarla alle impostazioni del campione. Quindi, eseguire il campione di epatociti per misurare il livello NTCP. Quindi, iniziare ad analizzare gli epatociti colorati selezionando in serie sulle finestre BD FACSuite, il tubo di controllo e quindi la scheda delle fonti di dati.
Attendere la visualizzazione dei dati non elaborati. Successivamente, nella scheda del foglio di lavoro sul lato destro, fare clic sul pulsante del cancello di ellisse, selezionare la popolazione di celle e SSC e il diagramma di punti FSC utilizzando il cursore del mouse. Quindi attendi che appaia il cerchio P1.
Fare clic sul pulsante del cancello dell'intervallo e contrassegnare la regione nell'istogramma colorato con isotiocianato di fluoresceina. A partire dal valore di intensità di fluorescenza più alto sul lato destro. La riga P2 viene visualizzata sullo schermo.
Fare clic sulla provetta dell'esperimento e osservare che i dati nella scheda del foglio di lavoro cambiano. Fare clic sul pulsante delle statistiche e poi sullo spazio vuoto e sul foglio di lavoro. Quindi, osservare i valori statistici della popolazione polipeptidica co-trasportatrice del taurocolato di sodio.
Aspirare il mezzo dalle piastre del pozzetto MHC confluente al 100% e aggiungere quattro ciclosporina micromolare A diluita con E Medium di William per due ore. Quindi, aspirare il candidato inibitore dell'ingresso del virus dell'epatite B per sostituirlo con un millilitro di Williams E Medium contenente il 4% di glicole polietilenico. Quindi, incubare il terreno di coltura con particelle di virus dell'epatite B a una molteplicità di infezione di 100 per pozzetto per 18 ore a 37 gradi Celsius.
Quindi, scartare il surnatante a due millilitri di PBS freddo e ruotare delicatamente per risciacquare il vecchio mezzo con virus dell'epatite B non legato. Dopo aver coltivato le cellule con due millilitri di William's E Medium completo per sette giorni, lavare le cellule con PBS e fissarle con aldeide paraforme al 3,7% e PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Incubare sequenzialmente le cellule infette con una soluzione bloccante IF per 60 minuti a temperatura ambiente nell'anticorpo primario a una diluizione da uno a 200 nella soluzione bloccante durante la notte a quattro gradi Celsius.
Quindi somministrare tre lavaggi di un minuto ciascuno utilizzando la soluzione di lavaggio prima di incubare le cellule con l'anticorpo secondario in una diluizione da 500 a 500 per un'ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio tre volte, montare il campione con un supporto di montaggio anti-sbiadimento con DAPI e coprirlo con una vetrina. Utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di filtri DAPI e PE rilevare il segnale di fluorescenza con una lente obiettivo 20 x per determinare l'attività di ingresso anti HBV dei composti candidati.
Per il test di legame cellulare, preparare le cellule come dimostrato in precedenza e incubarle con particelle di virus dell'epatite B a quattro gradi Celsius per due ore. Dopo aver scartato il mezzo, sciacquare le cellule con due millilitri di PBS freddo con un leggero vortice. Quindi raccogliere le cellule infette usando un raschietto cellulare e interrompere le cellule con tampone di lisi.
Trasferire il lisato cellulare in una provetta di raccolta per estrarre il DNA totale con reazione a catena della polimerasi utilizzando le condizioni di temperatura descritte nel manoscritto. Dopo aver preparato le cellule come dimostrato in precedenza, incubare gli epatociti con la soluzione di acido taurocolico di sodio per 15 minuti a temperatura ambiente, aspirare la soluzione e lavare le cellule tre volte con HEPES freddo. Quindi, aggiungere da 300 a 500 microlitri di HEPES freddo per raccogliere le cellule con raschietti cellulari su ghiaccio.
Omogeneizzare le cellule mediante ultrasuoni a 20 kilohertz per 20 secondi e incubare su ghiaccio per cinque minuti. Dopo la centrifugazione a 10.000 G, raccogliere il surnatante e valutare la concentrazione intracellulare di acido taurocolico utilizzando un kit di analisi ELISA dell'acido taurocolico. Per lavare le cellule e la siringa nella calorimetria a titolazione isotermica o nello strumento ITC, avviare il software ITC.
Nella scheda Esegui esperimento evidenziato, selezionare Metodo micro cal per 19 punti di iniezione ITCM e fare clic su Apri. Quando si apre una nuova finestra, fare clic sulla scheda Pulisci e nella finestra del metodo di pulizia selezionare il pulsante di lavaggio per il metodo di pulizia delle celle e il pulsante di risciacquo per il metodo di pulizia della siringa. Fare clic su Avanti e seguire le istruzioni visualizzate.
Dopo aver caricato l'esempio nell'ITC, fare clic sul pulsante di caricamento presente nella scheda Esegui esperimento. Quindi fare clic su Avanti e seguire le istruzioni video fino al completamento di questa fase di caricamento. Usando una siringa, riempire la cella di riferimento con tampone di soluzione nella cella campione con 15 micromolari NTCP nel tampone.
Rimuovere la soluzione in eccesso, quindi riempire la siringa con una soluzione di 150 Micromolari Curcumin Ligando, evitando bolle d'aria. Esegui l'esempio facendo clic sul pulsante Esegui nella scheda Esegui esperimento. Le informazioni sperimentali e le impostazioni verranno visualizzate sul lato sinistro.
Inserisci le concentrazioni di proteine del ligando e i dettagli della temperatura. Fare clic su Start per eseguire il processo di iniezione. Attendere 1,4 ore per il completamento dell'interazione del ligando proteico.
Una volta completata l'iniezione, selezionare il pulsante di analisi evidenziato per analizzare i dati grezzi utilizzando il software di analisi. Quindi, fare clic su Panoramica per visualizzare i dati grezzi e scegliere il modello di adattamento come un set di siti di associazione. Sono state osservate caratteristiche di maturazione epatica, tra cui cellule binucleate e morfologia di forma poligonale, specialmente nello stadio differenziato di MHC.
Un grande aumento dell'espressione di NTCP è stato osservato in HepaRG differenziato e MHC differenziato. La forma altamente glicosilata di NTCP è stata rilevata più nell'MHC differenziato che nell'HepaRG differenziato. I livelli di NTCP erano più alti nelle cellule MHC differenziate rispetto alle cellule indifferenziate.
La colorazione con immunofluorescenza virale ha valutato le attività di ingresso anti HBV il settimo giorno dopo l'infezione e il livello di legame del virus sul recettore della superficie cellulare è stato valutato mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale. L'analisi dell'assorbimento dell'acido taurocolico ha suggerito che l'attività inibitoria punitiva dei composti candidati ha ridotto il legame del virus dell'epatite B attraverso NTCP. L'alterazione colorimetrica è stata rilevata con continue iniezioni alla cellula campione.
Una regressione standard non lineare dei minimi quadrati è stata tracciata sulla base di un sito di legame adattato bene ai dati. La linea continua indicava la migliore corrispondenza ai valori sperimentali per il legame delle FFS come a e che le cellule e la particella virale dell'epatite B vengono incubate a quattro gradi Celsius. L'aggiornamento dell'acido taurocolico può essere valutato utilizzando la tecnica radioattiva.
Il livello di acido taurocolico radioattivo può essere quantificato utilizzando un contatore di simulazione liquida. Questa tecnica è semplice e veloce per lo screening per l'ingresso virale nell'attività di indagine di qualsiasi regime antivirale che aiuterebbe a prevenire l'infezione o la reinfezione.
