Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo post-natale sul modo in cui l'allucchiamento del latte influenza la segnalazione dello stress nel cervello. Questa tecnica può essere utilizzata per catturare specifiche aree cerebrali durante il primo periodo di fame naturale e per confrontarle con le rispettive aree poco dopo il primo mangime naturale per colostro. Comprendere come l'allucchio influenzi la fisiologia del comportamento e delle emozioni consente l'uso di un antagonista a vari recettori durante l'analisi ex-vivo del tessuto cerebrale.
Per ottenere i pugni dei nuclei, rimuovere i cuccioli di ratto dalla coda con una mano guantata. Dopo aver raccolto il cervello, posizionare rapidamente l'intero organo in uno stampo cerebrale polimetilmetacrilato a temperatura ambiente e utilizzare immediatamente una nuova lama di rasoio per fare fette spesse 500 micrometri del tessuto. Posare le fette rostrali a caudal in una piastra di Petri in quanto si ottengono per mantenere il corretto orientamento delle sezioni.
Quando l'intero cervello è stato sezionato, aggiungere rapidamente liquido spinale cerebrale artificiale senza glucosio al piatto e incubare le fette per 60 minuti a 28-30 gradi Celsius con agitazione costante su uno shaker orbitale. Usa un atlante cerebrale e punti di riferimento anatomici su ogni tessuto per identificare i nuclei cerebrali da colpire e posizionare la fetta con i nuclei di interesse in una nuova piastra di Petri al microscopio sezionato. Una volta visualizzato, utilizzare uno strumento di coring per punzonare rapidamente da quattro a sei nuclei diversi e immergere rapidamente ogni nucleo perforato in 0,06 ml di tampone di estrazione di proteine fredde nel tubo di microcentfuga opportunamente etichettato contenente inibitori del proteo e inibitori della fosfatasi per 60 minuti.
Al termine dell'incubazione, centrifugare i nuclei estratti in una mini-centrifuga raffreddata e utilizzare una micro-pipetta per trasferire con cura 0,055 mL di supernatante da ciascun tubo nell'appropriato tubo di micro-centrifuga pre-raffreddato da 1,5 ml sul ghiaccio. Prima dello stoccaggio negativo di 20 gradi Celsius, trasferire 0,012 ml di supernatante da ogni tubo di stoccaggio proteico nel tubo pre-raffreddato da 0,5 ml appropriato sul ghiaccio per la prima preparazione del campione. Per preparare i campioni per la misurazione delle proteine capillari, aggiungere 0,003 ml di reagente master mix da un kit di lysis proteica a ciascuno dei campioni nei tubi etichettati da 0,5 ml.
Successivamente, aggiungere 0,004 ml di reagente master mix a una soluzione di scala del peso molecolare biotinilata in 0,016 ml di acqua deionizzata e denaturare i campioni di scala ed estratto proteico in un blocco di calore di 95 gradi Celsius, immagazzinando tutti i tubi a quattro gradi Celsius dopo cinque minuti. Per l'analisi delle proteine del segnale, aggiungere 0,01 mL di soluzione di perossido di luminolo appena preparata ai pozzi da E-1 a E-25 di una nuova piastra occidentale automatizzata, 0,01 mL di anticorpo anti-topo secondario ai pozzi da D-2 a D-25 e aggiungere 0,01 mL di perossidasi di rafano streptavidina dal kit al pozzo D-1. Aggiungere 0,01 mL di anticorpo primario appena preparato nei pozzi da C-2 a C-25 e 0,01 mL di anticorpi diluenti due soluzioni ai pozzi da C-1 e B-1 a B-25.
Lasciare vuoti i pozzali F di fila e riempire i cinque scomparti delle tre file sotto la fila F con 0,45 mL di tampone di lavaggio. Successivamente, ruotare brevemente i campioni refrigerati per 30 secondi e aggiungere 0,03 mL di ogni campione a ogni pozzo della fila A, a partire da A-2. Quindi, aggiungere 0,005 mL della scala del peso molecolare biotinilata al pozzo A-1 e coprire la piastra per la centrifugazione.
Mentre la piastra è centrifugata, aprire un nuovo file di esecuzione nel software associato occidentale automatizzato e avviare un test di dimensione molecolare. Nella pagina di dosaggio, inserire i nomi dei campioni in ogni capillare e i nomi degli anticorpi primari e secondari. Al termine della centrifugazione, posizionare la piastra nello strumento occidentale automatizzato e sbucciare il coperchio dalla scatola della cartuccia capillare.
Dopo la centrifugazione, non dimenticare di ispezionare le bolle d'aria, perché le bolle d'aria nel capillare possono bloccare la corrente elettroforetica e fallire l'intero round. Inserire la cartuccia nella posizione designata all'interno dello strumento e chiudere la porta. Fare clic sul pulsante Start.
Quando viene richiesto il tipo di saggio, immettere il nome dell'esperimento nella casella di testo appropriata e fare clic su OK. Quando richiesto dalla data di esecuzione attivata e dal numero ID nel file di esecuzione, prendere nota dell'ora di fine dell'esecuzione. Alla fine della corsa, scartare la cartuccia capillare nello smaltimento dei taglienti e la piastra nello smaltimento dei materiali pericolosi.
Dopo la separazione dell'elettroforesi, controllare i file di esecuzione per i picchi di reattività immunitaria degli antigeni a 40-43 kilodalton che stanno per fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica fosforilato 2A. Dove mancano picchi di peso molecolare di queste dimensioni, fare clic con il pulsante destro del mouse sotto la curva e scegliere aggiungi peso molecolare al picco per garantire che le dimensioni e le quantità arbitrarie al di sotto della curva siano registrate. All'interno dei campioni di tessuto unprimeds, i livelli di proteina ammino globulina leganti nei nuclei della pista solitaria sono significativamente più alti rispetto a tutte le altre regioni.
L'adescamento del tessuto intestinale con colostro diminuisce i livelli di proteina ammino globulina leganti nei nuclei della pista solitaria e non ha alcun effetto sui nuclei paraventricolari e sui nuclei super-ottici. Al contrario, l'adescamento aumenta i livelli di proteina dell'ammino globulina legante all'interno della corteccia, dei nuclei di striazione e dei nuclei preoptici mediali rispetto al tessuto non primo, il che implica che i livelli di proteina ammino globulina leganti nei vari nuclei cerebrali testati rispondono in modo diverso all'adescamento intestinale e non esiste ancora un crosstalk dimostrato tra i vari nuclei testati. Il fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A e il fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica fosforilata 2A sono elevati nella condizione non primata rispetto ad altri nuclei.
Dopo l'adescamento, i livelli sia del fattore di iniziazione della traduzione eucariotica 2A che del fattore di iniziazione alla traduzione eucariota fosforilato 2A sono ridotti rispetto ai nuclei della traccia solitaria rispetto al tessuto non primo. In tutti gli altri nuclei testati, l'adescamento aumenta i livelli del fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A e del fattore di iniziazione alla traduzione eucariota fosforilato 2A rispetto al tessuto non primo. Tuttavia, i livelli di recettore della protein chinasi fosforilata sono bassi nei campioni nonprimi rispetto ai campioni innescati nei nuclei della pista solitaria, suggerendo fortemente che un'altra chinasi sia coinvolta nella fosforilazione del fattore di iniziazione alla traduzione eucariotica 2A.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo post-natale per esplorare i percorsi di segnalazione coinvolti nella crescita e differenziazione dei tessuti e se sono influenzati o indipendenti dall'allucchio. Non dimenticare che lavorare con agenti riducenti volatili come, ad esempio, ditiothreitol, può essere pericoloso e precauzioni come la preparazione nella cappa chimica dovrebbero sempre essere prese durante la preparazione di questa procedura.
