La barriera intestino-emato-ematica è un sistema multistrato che controlla il passaggio di nutrienti, metaboliti batterici, farmaci e altri composti esogeni dal lume intestinale al flusso sanguigno. Come sappiamo, l'integrità della barriera può essere compromessa sia nel flusso gastrointestinale che in quello cardiovascolare e in alcune malattie metaboliche che possono comportare un più facile accesso di composti biologicamente attivi come i metaboliti batterici intestinali al flusso sanguigno e possono influire sul funzionamento dell'intero organismo. Pertanto la permeabilità della barriera e intestino-ematica può essere un marcatore di malattie intestinali ed extraintestinali.
In questo video, presentiamo una misurazione diretta della permeabilità della barriera intestino-ematica nei ratti utilizzando il prelievo del sangue a portale dopo la somministrazione di una sostanza in esame al tratto digestivo. Descriviamo in dettaglio la categorizzazione della vena porta e della vena cava inferiore appena sopra la confluenza epatica della vena. Il prelievo di sangue dalla vena portale e dalla vena cava inferiore consente di valutare non solo la permeabilità della barriera intestino-ematica, ma anche una via di clearance epatica e assorbimento di molecole di interesse come metaboliti o medicinali dei batteri intestinali.
Questo metodo non è praticamente influenzato dalla funzione epatica e renale e preserva il flusso sanguigno intestinale, che è un forte vantaggio rispetto ai metodi in vivo e in vitro comunemente usati. Gli animali devono essere digiunati durante la notte prima della procedura. Eseguire tutte le procedure durante l'anestesia generale.
Gli animali vengono eutanasiati dopo l'esperimento. La nostra procedura inizia con l'inserimento della linea per la somministrazione intraintestinal. Qui proponiamo la somministrazione intracolonica del marcatore.
Può essere modificato dalla somministrazione a vari livelli del tratto digestivo. Ad esempio, stomaco o duodeno. Tuttavia, prendere in considerazione la velocità variabile della peristalisi e le possibili interazioni con enzimi e acidi gastrici mentre si somministra un marcatore nelle parti superiori del tratto gastrointestinale.
Utilizzare catetere Foley pediatrico di taglia 10 F o 8 F come catetere colon. Contrassegnare il catetere per indicare la parte che verrà inserita nel colon di circa otto centimetri. Controllare la regione anale e il conteggio delle feci nel retto prima di inserire il catetere nei due punti.
Se le feci sono presenti, svuotare il retto massaggiando l'area rettale. Metti un lubrificante lungo il catetere. Successivamente, inumidire l'ano e l'ambiente circostante con un lubrificante.
Inserire il catetere con un filo guida attraverso lo sfintere anale esterno. Fai movimenti lenti in avanti, indietro e circolari. Continuare a controllare la posizione del catetere per palpazione addominale mentre si inserisce il catetere.
Il prossimo passo è la cateterizzazione inferiore della vena cava. Puoi saltare questa procedura negli studi sulla permeabilità intestinale. Prova a sentire il polso sull'arteria femorale e taglia la pelle longitudinalmente per la lunghezza di circa due centimetri nel luogo in cui il polso è palpabile.
Sezionare la fascia e i muscoli per visualizzare il fascio neurovascolare. Quindi, sezionare la vena femorale dal fascio neurovascolare. Prima i nervi, poi l'arteria femorale e poi la vena.
Fai attenzione durante la dissezione del fascio poiché diversi piccoli rami della vena femorale possono essere facilmente danneggiati. Quindi metti due legature sulla vena femorale. Non legare ancora i nodi.
Prendi le estremità della legatura prossimale con un portaaghi. Quindi tirare con cura le estremità della legatura con il supporto verso l'alto per chiudere la parte prossimale della vena. Attendere fino a quando la vena è piena di sangue e legare il nodo distale.
Successivamente, fare una piccola incisione sulla vena tra il nodo e la legatura prossimale usando forbici microchirurgiche. Quindi inserire il catetere usando una pinzetta o un ago con un'estremità curva come facciamo nel video. Forare la vena e utilizzare la punta piegata dell'ago come guida per il catetere.
Allentare la legatura prossimale inserendo il catetere. Inserire il catetere per circa sei-sette centimetri a seconda delle dimensioni di un animale per posizionare la punta prossimale del catetere nella vena cava inferiore appena sopra la confluenza della vena epatica. Il corretto posizionamento del catetere deve essere confermato dopo l'esperimento.
Fissare il catetere nella vena femorale con due singoli nodi chirurgici. Legare anche la legatura prossimale. Controllare la persistenza del catetere tentando di prelevare il sangue con una siringa.
Risciacquare il catetere con uno 0,3 millilitri della salina eparinata. Chiudere la ferita chirurgica con due strati di punti singoli. Ora passiamo alla cateterizzazione delle vene portale.
Preparare il catetere portale. Consiste in ago, catetere in poliuretano flessibile, punta flessibile in polietilene del catetere, spina e legatura. Il primo passo della procedura consiste nell'eseguire una laparotomia della linea mediana.
Dopo aver preparato il campo operatorio, tagliare la pelle longitudinalmente dallo xifoide dello sterno all'ombelico. Tagliare i muscoli della parete addominale lungo la linea bianca. Quindi, espandere il taglio rostralmente nella forma y in modo che la cartilagine xifoide sia compresa tra due tagli.
Il prossimo passo è la dissezione delle vene portale. In primo luogo, inumidire i tamponi con soluzione salina. E poi esternalizza il cieco, il colon ascendente e trasversale e l'anello dell'intestino tenue.
Metti l'intestino sul lato sinistro per esporre la radice del mesentere. Coprire l'intestino con garza inumidita con una fisiologica salina per proteggerli dall'essiccazione. Per esporre la vena porta spostare con attenzione i lobi epatici ai lati o verso l'alto verso il diaframma con i tamponi inumiditi.
Qui possiamo vedere la vena portale e la vena mesenterica superiore. Localizzare la parte della vena porta che non è coperta dal mesenterio e passare la legatura sotto la vena porta. Per proteggere i tessuti dai danni, inumidire la legatura con una fisiologica soluzione salina.
Blocca con forza le estremità della legatura e stringilo delicatamente per stabilizzare il vaso. Passare la parte più lunga della legatura del catetere sotto la parte libera della vena del portale e tirarla in modo che il catetere si trovi proprio accanto alla vena del portale. Inserire l'ago nella vena mesenterica superiore tre millimetri sotto la giunzione della vena mesenterica superiore e della vena porta.
Tenere l'ago con un angolo di 30 gradi e dopo essere entrati nella vena ridurre l'angolo e far avanzare l'ago quasi orizzontalmente in parallelo alla vena porta per una lunghezza di circa sei-sette millimetri. Applicare una o due gocce di colla tissutale nel punto in cui è inserito l'ago. Rimuovere i tamponi che coprivano il fegato.
Successivamente rimettere l'intestino nella cavità addominale. Inumidire l'intestino con una soluzione salina riscaldata e coprirlo con una garza sterile inumidita. Controllare la persistenza del catetere e sciacquare il catetere con soluzione salina eparinata.
Il sangue venoso riflue spontaneamente nel catetere. Dopo cinque minuti controllare il colore dell'intestino e i movimenti peristaltici per assicurarsi che il corretto flusso sanguigno mesenterico sia mantenuto. Alla fine, chiudere la cavità addominale con tre strati di punti esteriormente la parte distale del catetere intorno all'ombelico.
Per raccogliere il sangue dalla vena del portale, aprire la spina del catetere portale e lasciare che il sangue fluisa liberamente. Utilizzare una siringa e un ago smussato e raccogliere non più di 0,7 millilitri di sangue. Risciacquare il catetere con soluzione salina eparinizzata e chiudere la spina del catetere.
Qui presentiamo protocolli di prelievo del sangue portale esemplari per la valutazione della permeabilità intestinale. Campioni di sangue della vena cava inferiore sono necessari per gli studi di clearance epatico e assorbimento. Per raccogliere il sangue dalla vena cava inferiore procedere esattamente come quando si prende il sangue dalla vena portale.
Qui presentiamo un protocollo esemplare di prelievo del sangue per la misurazione della clearance epatica e per il monitoraggio della via ematica-epatica-sistemica del portale intestinale di composti selezionati. Nei nostri studi abbiamo usato un metabolita batterico, la trimetilammina come marcatore di permeabilità. Tuttavia, possono essere utilizzate anche molte altre sostanze, compresi i marcatori di permeabilità di classe.
Vari batteri, metaboliti e tratti possono anche essere utilizzati per trattore la via di assorbimento o la clearance epatica. Rimuovere il filo di guida e gonfiare il palloncino utilizzando un volume adeguato di acqua sterile di solito un millilitro, ma controllare effettivamente le dimensioni del palloncino prima dell'inserimento. Il diametro del palloncino non deve superare un centimetro.
Posizionare la testa del topo verso il basso per ridurre al minimo il rischio di deflusso della soluzione somministrata dal colon. Somministrare lentamente la sostanza testata utilizzando la porta di drenaggio e il catetere colon. Abbiamo usato la trimetilammina in una dose di 100 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo sciolto in 0,7 millilitri di soluzione salina.
Dopo dieci minuti sgonfiare il palloncino del catetere. La clearance epatica intesa come estrazione epatica può essere espressa dalla differenza tra la concentrazione del sangue portale e la concentrazione inferiore di sangue di vena cava o dal rapporto tra vena cava inferiore e concentrazione di sangue portale. Abbiamo misurato con successo la permeabilità alla barriera e intestino-epatica e la clearance epatica della trimetilammina nei ratti.
Ecco i risultati rappresentativi che dimostrano che i ratti ipertesi hanno aumentato la permeabilità del colon alla TMA rispetto ai ratti normotensivi. In un'altra ricerca abbiamo studiato se un elevato apporto di sale influisce sulla permeabilità della barriera intestino-ematica e sulla clearance epatica della trimetilammina. La somministrazione intracolonica di trimetilammina ha prodotto un aumento significativo della concentrazione di TMA nel sangue portale.
La dimensione dell'aumento e la clearance epatica erano simili tra i gruppi. Abbiamo anche monitorato la via di assorbimento degli acidi grassi a catena corta. Abbiamo misurato la concentrazione nelle feci, nel sangue portale e nel sangue periferico.
In questo video abbiamo descritto un protocollo completo che include la misurazione diretta della permeabilità della barriera e intestino-ematica in vivo che, a differenza dei metodi comunemente usati, non è influenzata da funzioni epatiche e renali, misurazione della clearance epatica e, in terzo luogo, valutazione della via di assorbimento dei composti esogeni. La tecnica presentata può essere adattata ad altri scopi sperimentali. Ad esempio, misurazione della pressione sanguigna portale o somministrazione di farmaci direttamente alla vena portale.
