L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le malattie causate dalla disfunzione della barriera epiteliale misurando la permeabilità delle cellule epiteliali intestinali in vitro e in vivo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della funzione barriera intestinale, come quelle relative alla malattia infiammatoria intestinale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la permeabilità cellulare epiteliale intestinale può essere valutata sia in vitro che in vivo.
Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia o la diagnosi di malattie gastrointestinali, perché la disfunzione della barriera epiteliale intestinale contribuisce a tali malattie. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla funzione di barriera intestinale, può anche essere applicato ad altri sistemi, come studi sulla tossicità dei farmaci e integrità della barriera di altri tipi di cellule. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché alcuni passaggi sono difficili da apprendere.
Un'operazione accurata di questo metodo può ora essere compresa mediante descrizione testuale. Per iniziare, far crescere le cellule caco-2bbe in un pallone T75 con mezzo. Nutrire regolarmente i contenitori, a seconda della densità cellulare.
Quando le cellule sono confluenti all'80%, rimuovere il mezzo e utilizzare 1-2 millilitri di PBS sterile senza calcio per risciacquarli. Aggiungere 1,5 millilitri di Triptina-EDTA e scuotere delicatamente il pallone. Quindi, posizionalo nell'incubatore di 37 gradi Celsius per 20 minuti, senza dondolare.
Mentre le cellule sono tripinalizzanti, posizionare inserti contenenti membrane porose in policarbonato in 24 piastre di pozzo. Quindi aggiungere 1 millilitro di mezzo di coltura nella camera basale che è lo spazio inferiore della membrana. Aggiungere 5 millilitri di mezzo al pallone e pipettare vigorosamente le cellule contro l'interno del pallone da 5 a 10 volte, per separare la coltura in singole cellule sciolte o grumi da due a tre cellule.
Piastra 0,166 millilitri delle cellule nella camera apicale che è lo spazio superiore della membrana. Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un massimo di tre settimane. Nutrire le cellule tre volte alla settimana, utilizzando una pompa di pressione per aspirare con cura il mezzo dal compartimento basale di ogni pozzo.
Quindi gocciolare delicatamente un millilitro di mezzo nella camera apicica di ogni inserto. Per gli studi sulle citochine, un giorno prima della resistenza elettrica transepiteliale o delle misurazioni ter, sostituire il mezzo basale con mezzo, contenente 10 nanogrammi per millilitro di gamma di interferone. Il giorno dell'esperimento, sostituire il mezzo con HBSS contenente 2,5 o 7,5 nanogrammi per millilitro di TNF.
Per correggere il misuratore, inserire l'elettrodo di correzione nella porta di ingresso e scegliere la modalità Ohm. Quindi utilizzare un cacciavite per regolare la vite di regolazione R fino a quando il misuratore non visualizza una lettura di 1.000 ohm. Sterilizzare gli elettrodi in 70%etanolo per 15-30 minuti e lasciare asciugare l'aria per 15 secondi.
Quindi sciacquare gli elettrodi nel mezzo sperimentale di coltura cellulare. Quindi, accendi l'alimentazione e scegli la modalità Ohm. Mantenendo gli elettrodi verticali, posizionare con cura le lunghe estremità dei ponti degli elettrodi nella camera basale, assicurandosi che tocchino il piatto.
Quindi posizionare le estremità corte nella camera apicale, assicurando che rimangano sotto la superficie del mezzo, ma sopra gli inserti di coltura tissutale. Misurare la resistenza del campione e degli inserti vuoti a 0, 1, 2, 3 e 4 ore dopo il trattamento con citochina. Quindi registra la resistenza.
Per ottenere coerenza tra i diversi formati di piastra, calcolare il prodotto della resistenza e l'area effettiva della membrana come mostrato qui. Per 24 inserti di pozzo, l'area effettiva della membrana è di 0,33 centimetri quadrati. Per indurre la colite, aggiungere DSS all'acqua autoclavata a una concentrazione finale del 3,5% di peso per volume.
Quindi utilizzare la soluzione DSS per sostituire l'acqua potabile nelle gabbie di sei topi neri C57 maschi di 8 settimane per un totale di sette giorni. Dare acqua potabile regolare senza DSS per controllare i topi. Dopo il settimo giorno, passare l'acqua DSS all'acqua potabile normale.
Ogni giorno, pesare i topi e valutare i punteggi clinici definiti in base alla gravità della malattia da quattro parametri: prolassi rettale, consistenza delle feci, sanguinamento e attività. Sommare i punteggi di questi parametri per un punteggio clinico finale. Analizzare le condizioni istopatologiche dei tessuti del colon sette giorni dopo il trattamento DSS, dopo aver eutanasiato i topi secondo il protocollo di testo, isolare il colon e il cieco e misurare la lunghezza del colon.
Tagliare segmenti di 0,5 centimetri dal colon distale e fissare il tessuto in un tubo di falco da 15 millilitri contenente 10 millilitri di formalina al 10% durante la notte. Lavare i tessuti fissi con etanolo graduato e xilene. Quindi incorporare i tessuti in paraffina e tagliare sezioni di sei millimetri per la colorazione ematossilina ed eosina.
Per misurare la permeabilità della barriera epiteliale nei topi indotti dal DSS, sette giorni dopo l'inizio della somministrazione del DSS, velocizza i topi per tre ore. Autoclave un ago di gavage per garantire la sterilità, quindi utilizzare 150 microlitri da 80 milligrammi per millilitro quattro kilodalton FITC dextran in acqua sterile per gavage i topi e mantenere il dextran FITC inutilizzato per misurare la curva standard dopo la raccolta del siero. Successivamente, pesare i topi per il calcolo della permeabilità.
Quattro ore dopo, dopo aver anestetizzato i topi per iniezione IP, confermare una corretta anestesia per la mancanza di riflessi e movimento del baffo. Quindi posizionare i topi su un blocco di calore per cinque minuti. Usando un paio di forbici, aggancia un pezzo di un centimetro della coda e raccogli 100 microlitri di sangue dalla coda in un tubo di raccolta del siero.
Far girare il sangue raccolto a 10.000 volte g e la temperatura ambiente per dieci minuti. Con l'acqua, diluire il siero uno a quattro. Quindi, per fare una curva standard, utilizzare l'acqua per preparare le diluizioni del dextran FITC inutilizzato.
Aggiungere 100 microlitri per pozzo del siero e i campioni di curva standard in 96 piastre di pozzo. Utilizzando un lettore di lastre, leggere la fluorescenza ad un'eccitazione di 485 e un'emissione di 528. Calcolare i valori di permeabilità in base alla curva standard e moltiplicarli per quattro per correggere la diluizione.
Dividere la concentrazione di Dextran FITC per il peso per normalizzare i valori. Questo aiuta a normalizzare la differenza nel parto di Dextran FITC se i topi sono malati e hanno perso peso. Le cellule caco-2bbe qui mostrate sono state etichettate con nuclei e macchie di F-actin per mostrare la differenza tra cellule indifferenziate e differenziate.
Le fibre di stress sono chiaramente viste nelle cellule indifferenziate. Le cellule differenziate hanno un volume inferiore, nuclei più grandi e meno fibre di stress rispetto alle cellule indifferenziate. Il TNF è fondamentale per la perdita di barriera intestinale attraverso la regolazione della giunzione stretta dipendente dalla MLCK.
Come si vede in questa figura, il TNF diminuisce significativamente il TER del monostrato Caco-2bbe in modo dose-dipendente, suggerendo che il TNF aumenta la permeabilità epiteliale. Rispetto al loro peso corporeo iniziale, i topi trattati con DSS perdono una quantità significativa di peso. La gravità della colite è segnata da prolassi rettale, consistenza delle feci, sanguinamento e attività.
Sezioni trasversali di tessuti colonici macchiati di ematossilina ed eosina mostrano danni alla mucosa colon nei topi trattati con DSS. Inoltre, la lunghezza della cripta del colon, così come il colon stesso, è diminuita nei topi trattati con DSS. Infine, c'è un aumento di circa due volte dei livelli di colorazione di dextran FITC nei topi trattati con DSS, rispetto ai topi di controllo.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo gli errori, standardizzando le procedure operative e utilizzando metodi statistici. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della funzione barriera intestinale per esplorare le malattie gastrointestinali sia negli organismi modello che nelle linee cellulari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la permeabilità epiteliale intestinale misurando il TER, gavaging FITC dextran e osservando i cambiamenti morfologici e istochimici.
