Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia aviaria, come il modo in cui i virus immunosoppressivi interagiscono con le cellule B. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule sono più rilevanti delle linee cellulari immortalate attualmente utilizzate in laboratorio. Sebbene questo metodo fornisca informazioni su come le cellule di pollo rispondono all'IBDV, può anche essere applicato ad ALV e REV.
Questo metodo riduce il numero di uccelli nella nostra ricerca ed è vantaggioso per le tre R, che sta per la sostituzione, la riduzione e il perfezionamento dell'uso di animali nella ricerca. In un armadio di sicurezza microbiologico, lavare il BF in 30 millilitri di PBS freddo almeno tre volte. Trasferire il tessuto lavato in una piastra di Petri e aggiungere cinque millilitri di una soluzione 1X di collagenasi D.
Utilizzare forbici sterili o una lama bisturi per tagliare il BF in pezzi di diametro inferiore a cinque millimetri. Incubare a 37 gradi Celsius con agitazione delicata periodica per 30 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per aspirare ripetutamente la miscela per incoraggiare la disintegrazione del tessuto.
Aggiungere altri cinque millilitri di soluzione 1X di collagenasi D al tessuto e incubarlo a 37 gradi Celsius con agitazione delicata periodica per altri 30 minuti. Ripetere questo processo, aspirando la miscela, aggiungendo soluzione di collagenasi D fresca e incubando fino a quando il tessuto non viene completamente digerito. Si noti che ci saranno piccoli granuli che non si dissolveranno ulteriormente.
Passare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare da 100 micron in 20 millilitri di 1X HBBS senza calcio. Centrifuga a 400 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante, rimescolare il pellet in 10 millilitri di 1X RPMI con 5%FBS.
Quindi, sovrapporre 10 millilitri della sospensione cellulare sopra cinque millilitri di mezzi gradienti di densità che contengono polisucrose e diatrizoato di sodio. Assicurarsi che vi sia un'interfaccia chiara tra i due livelli. Centrifuga a 900 volte g e quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Le celle devono formare una banda all'interfaccia tra il supporto cellulare e il supporto gradiente di densità. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere le cellule e trasferirle in un tubo contenente PBS freddo. Lavare le cellule centrifugandole a 400 volte g per cinque minuti e quindi rimornendole in PBS freddo.
Ripetere questo lavaggio tre volte. In primo luogo, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Rimossare le celle in 30 millilitri di IMDM completo 1X.
Prendere un'aliquota della sospensione cellulare e aggiungerla a una soluzione blu Trypan. Contare il numero di celle vitali che escludono il blu di Trypan e determinare il numero di celle e la percentuale di vitalità. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti.
Risosopend le cellule in IMDM completo integrato con una diluizione uno-a-20 del ligando CD40 di pollo ad una densità di 10 milioni di cellule per millilitro. Coltura delle cellule in piastre da 96 o 24 pozzi per 48-72 ore. Da 48 a 72 ore dopo l'isolamento, scongelare un'aliquota del virus.
Vortice il campione, e conservarlo sul ghiaccio. Rimossare le celle bursal primarie nel mezzo IMDM. Prendere un'aliquota di 10 microlitri della sospensione cellulare e aggiungerla a 10 microlitri di una soluzione blu Trypan.
Quindi, determinare il numero di celle e la vitalità percentuale. Diluire il virus in 1X completare IMDM alla molteplicità appropriata di infezione per rendere il virus inoculo. Mescolare questa diluizione con il vortice.
Centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Quindi, rimuovere il supernatante e rimescolare le cellule nell'inoculo del virus. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora con agitazione periodica.
Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 400 volte g per cinque minuti. Rimuovere l'inoculo del virus e lavare le cellule in un supporto IMDM completo 1X. Coltura delle cellule in piastre da 96 o 24 pozzi.
In questo studio, le cellule bursali primarie di pollo vengono successivamente coltivate ex vivo in presenza di ligando CD40 di pollo solubile. Si vede che le cellule coltivate in presenza di ligando CD40 di pollo solubile aumentano di quattro volte da 902.000 a 3,63 milioni per millilitro in un periodo di sei giorni. La vitalità cellulare è anche significativamente migliorata in presenza di ligando CD40 di pollo.
Nelle immagini rappresentative della microscopia confocale, si vede che le cellule infette hanno una fluorescenza verde attorno al nucleo, che è coerente con la presenza di IBDV nel citoplasma. Questo è evidente per due ceppi di IBDV, un ceppo adattato alla coltura cellulare, D78, e un ceppo molto virulento, UK661. L'RNA viene quindi estratto a cinque, 18, 24 e 48 ore dopo l'infezione e sottoposto a RT-qPCR con primer specifici per una regione conservata del gene IBDV VP4.
L'espressione IBDV VP4 è vista aumentare a 16.603 copie a 48 ore dopo l'infezione da D78 e a 38.632 copie a 48 ore di postinfection con UK661. Questi dati dimostrano che le cellule bursali primarie di pollo possono supportare la replicazione di ceppi IBDV adattati alla coltura cellulare e molto virulenti. Seguendo questa procedura, altri metodi come RT-qPCR, microarray o RNA-Seq possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive, come come le cellule rispondono all'infezione.
Abbiamo confrontato il modo in cui le cellule rispondono all'infezione con un ceppo attenuato e un ceppo molto virulento di IBDV e il nostro ora indagare su come rispondono ad altre infezioni virali. La capacità di coltura di queste cellule ci consente di studiare aspetti della patogenesi virale e dell'immunosoppressione senza la necessità di infettare gli uccelli. Ciò avrà un impatto sostanziale sulle tre R, la sostituzione, l'affinamento e la riduzione dell'uso degli animali nella ricerca.
