Questo metodo estende la nanotecnologia del DNA dai materiali sorgente dell'oligonucleotide lineare, DAS, in qualche DAS più circolare. I principali vantaggi di questi tecnici sono che è un semplice, robusto e conveniente per la maggior parte dei laboratori. Per la purificazione circolare del DNA, aggiungere 20 microlitri di formamide a una soluzione di DNA circolare appena preparato e intatto, ad un volume finale di 140 microlitri con miscelazione.
Caricare da 16 a 20 microlitri di soluzione circolare di DNA in ciascuno dei sette o nove pozzi di gel PAGE denaturanti. Mescolare due microlitri di colorante di carico con otto microlitri del corrispondente DNA lineare precursore e iniettare la miscela in un pozzo di riferimento separato. Quindi far funzionare il gel per circa due ore a 10 volt per centimetro, fermando la corsa quando lo xilene cianolo FF può essere osservato circa due terzi lungo il gel.
Indossando guanti e occhiali di gomma, trasferire il gel su una piastra cromatografica fluorescente a strato sottile e utilizzare una lama di rasoio per tagliare le fasce di gel bersaglio, come oscurato dall'irradiazione UV. Mettere le fasce di gel in un tubo microcentrifugo a due millilitri per l'essiccazione, quindi schiacciare i gel essiccati in una pasta e aggiungere acqua deionizzata al doppio del volume del gel, per scuotere durante la notte a temperatura ambiente. La mattina seguente, filtrare la miscela in un tubo di microcentrifugo a due millilitri, risciacquando i lati del primo tubo con un piccolo volume di acqua deionizzata per recuperare qualsiasi DNA residuo e filtrando di nuovo per combinare i supernate.
Quindi purificare il DNA circolare attraverso la precipitazione dell'etanolo e conservare il DNA a meno 20 gradi Celsius. Per una ricottura in vaso, mescolare due microlitri di tampone di magnesio EDTA tris acetato da 10 volte, un microlitro di ogni soluzione di 10 micromolare di dna di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali e un buffer Tris EDTA aggiuntivo in una provetta PCR da 200 microlitri, a un volume finale di 20 microlitri. Quindi ricottura la soluzione di assemblaggio in una bottiglia termica da 95 a 25 gradi Celsius, per oltre 48 ore.
Per la ricottura in due fasi di reticoli infiniti, mescolare due microlitri di tampone in magnesio EDTA in acetato tris 10 volte, un microliter di ogni soluzione di 10 micromolare di stock di DNA di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali e un buffer Tris EDTA aggiuntivo in una provetta PCR da 200 microlitri, a un volume finale di 20 microlitri. Nella prima fase di ricottura delle sotto-piastrelle, ricotturare ogni soluzione di sotto-piastrella precursore in un termociclo PCR, utilizzando un metodo di raffreddamento lineare veloce da 95 a 25 gradi Celsius, per due ore e mezza. Per preparare la soluzione di assemblaggio, per ciascuno dei quattro reticoli infiniti, mescolare 10 microlitri di ciascuna delle due corrispondenti soluzioni di sottotegola insieme, ad una concentrazione finale di 0,25 micromolare per ogni filamento.
Nella seconda fase di ricottura del reticolo, ricottura la miscela di 20 microliter in un termociclometro PCR, utilizzando un metodo di raffreddamento lento. Per la ricottura in due fasi di due reticoli rettangoli finiti, mescolare un microlitro di 10 volte Tris acetato EDTA magnesio buffer, 0,5 microlitri di ogni soluzione di 10 micromolare di DNA stock di un insieme di filamenti lineari e circolari in rapporti molari uguali, e tampone Tris EDTA aggiuntivo in una provetta PCR da 200 microlitri, ad un volume finale di 10 microlitri. Nella prima fase di ricottura, ricottura ogni soluzione di sub-piastrella precursore nel termociclo pcr, utilizzando il metodo di raffreddamento lineare veloce, come dimostrato, da 95 a 25 gradi Celsius, in due ore e mezza, e mescolare le soluzioni di sotto-piastrella ricotta 32, ognuna con 2 microlitri, insieme in una provetta PCR da 200 microlitri, a un volume finale di 64 microlitri.
Quindi, nella seconda fase di ricottura, ricottura la miscela di 64 microliter nel termociclo, utilizzando il metodo di raffreddamento lento, come dimostrato. Per la purificazione dell'elettroforesi dei reticoli finiti, preparare un gel nativo del 2%agarosio e caricare 20 microlitri della soluzione reticolare finita in ogni pozzo, insieme all'aggiunta di 5 microlitri di una scala del DNA da 100 a 3000 coppie di basi, in un pozzo separato. Dopo aver esistito il gel per due ore a 5 volt per centimetro in un bagno d'acqua ghiacciata, tagliare le fasce di gel bersaglio a circa il livello del marcatore della coppia di basi 1000 sotto la luce UV, come dimostrato, e tagliare le bande di gel a pezzi fini.
Posizionare i gel frantumati in una colonna di filtro e centrifugare la colonna per estrarre i reticoli. Quindi, raccogliere la soluzione per l'imaging della microscopia a forza atomica. Per la purificazione finita del reticolo mediante glicole polietalene, o PEG, mescolare 50 microlitri della soluzione reticolare finita con un volume uguale di tampone 15%PEG 8000, centrifugare la soluzione e sospendere il pellet in 100 microlitri di buffer PEG, per una centrifugazione aggiuntiva.
Dopo la seconda centrifugazione, sospendere il pellet nel tampone di magnesio TRIS acetato EDTA, per l'imaging della microscopia a forza atomica. Per l'imaging infinito al microscopio a forza atomica reticolare 2D, scindere un nuovo strato di mica e depositare due microlitri del campione ricotto sulla superficie pulita. Lasciare che il DNA reticoli due minuti per assorbire sulla superficie della mica, prima di lavare la superficie due volte, con 100 microlitri di acqua deionizzata per lavaggio, asciugando la superficie con aria compressa dopo il secondo lavaggio.
Per ottenere immagini al microscopio a forza atomica dei reticoli di DNA infinito nell'aria, aprire la modalità di maschiatura nel software di imaging e impostare la dimensione della scansione su 0,5-cinque micrometri, la risoluzione della scansione su 512 linee e la velocità di scansione compresa tra uno e 3,5 Hertz. Quindi, scansionare la superficie della mica con sonde al microscopio a forza atomica triangolari. Per l'imaging finito dei reticoli di DNA, scindere un nuovo strato di mica, come dimostrato, e depositare 80 microlitri di un tampone di magnesio EDTA tris acetato di una piega sulla superficie pulita della mica.
Successivamente, aggiungere cinque microlitri di campioni finiti nel tampone, e permettere ai reticoli di DNA due minuti di assorbire sulla superficie della mica, prima di aggiungere altri 50 microlitri di tampone di magnesio EDTA tris acetato alla sonda. Quindi, impostare la dimensione della scansione su 0,5 a un micrometro, la risoluzione della scansione su 256 linee e la velocità di scansione su 1,5 Hertz, prima di scansionare la superficie con le sonde triangolari, come dimostrato. Il DNA circolare si muove leggermente più lentamente del suo DNA lineare precursore nella PAGINA denaturante, perché il poro all'interno del DNA circolare è penetrato e ritardato dalle fibre di gel.
Le famiglie circolari di assemblaggio nucleotidico 64 hanno una sola fascia chiara e pulita per ogni assieme, confermando la stabilità dei loro motivi monomeri. Le 84 famiglie circolari di assemblaggio nucleotidici di piastrelle, tuttavia, hanno strisci attorno alle loro bande principali, indicando la presenza di piccoli by-products. Indipendentemente dal minore da prodotti di associati errati, ottimi reticoli ad alte rese possono essere assemblati dai motivi monomeri target.
Ogni assieme ha le sue caratteristiche morfologiche nella scala dei micrometri, come nanofili, nanotubi, nanospirali, nanoribboni e nanoreclicoli. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare, in particolare, la contaminazione da detriti durante o fuori dai passaggi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alle ricerche nel campo della nanotecnologia del DNA per esplorare nuovi membri della famiglia di alcune nanotecnologie del DNA più circolari.
