Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla capacità dei ligandi estrogenici di regolare l'alfa del recettore degli estrogeni e i meccanismi dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo semplice. Dimostra l'attività di dimerizzazione del dominio dimerizzazione del dominio del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando nelle cellule.
A dimostrare la procedura sarà Tanner Jefferson, uno studente postdoc del nostro gruppo. Questo metodo utilizza tre diversi plasmidi per rilevare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni nelle cellule. pG5-Luc è il plasmide reporter luciferasi per rilevare l'efficacia dell'attività di dimerizzazione.
Il recettore degli estrogeni del topo pBIND alpha EF è un fattore di trascrizione galattosio-responsive GAL4 DNA legato a un principale plasmide di espressione del dominio alfa ligando del topo fuso che si lega all'elemento reattivo GAL4 sul reporter pG5-Luc. PACT mouse estrogen receptor alpha EF è un virus herpes simplex transactivating segment protein VP16 dominio di attivazione fuso mouse estrogeno recettore alfa ligando legame dominio espressione plasmide che non si lega direttamente al giornalista pG5-Luc. Quando è presente il ligando corretto, le proteine derivate dal recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e dal recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi si legano attraverso il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni.
L'efficienza della dimerizzazione è determinata dall'attività della luciferasi. Il passo più importante è controllare l'attività del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa proteina derivata da EF. L'attività del recettore degli estrogeni derivato da pBIND alfa ligando legare il dominio in ogni ligando senza il recettore degli estrogeni pACT alfa EF plasmide deve essere valutata prima di analizzare l'attività di dimerizzazione del dominio legante del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando.
Inizia aggiungendo le combinazioni plasmide appropriate in due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per combinazione. Preparare le due combinazioni della miscela di DNA. Il primo tubo contiene pG5-Luc, recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e plasmidi pACT vuoti.
Il secondo tubo contiene i pG5-Luc, il recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e i plasmidi pACT-recettore-estrogeno-alfa EF. Per far precipitare il DNA, aggiungere un 1/9 del volume della miscela di DNA di tre acetati di sodio molare e un volume di acetato di sodio molare 20X del 100% di etanolo alla miscela di DNA in ogni tubo e vortice dei tubi. Conservare le miscele a 20 gradi Celsius durante la notte prima di centrifugare alla massima velocità la mattina successiva.
Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet invisibili in 120 microlitri di 75% di etanolo per tubo, facendo attenzione a risciacquare qualsiasi DNA attaccato all'interno dei tubi. Dopo una seconda centrifugazione nelle stesse condizioni, scartare i supernatanti e asciugare il DNA in un concentratore sottovuoto per 30 minuti. Per la trasfezione, lavare due volte le cellule carcinoma epatocellulari umane preparate con 0,5 millilitri di PBS a temperatura ambiente per pozzo per lavaggio e nutrire le cellule con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius, integrato con siero bovino fetale inattivato al carbone del 10% e due L-glutammina millimolare.
Successivamente, sospendere la miscela di DNA plasmide essiccato e il reagente di trasfezione nel volume appropriato di DMEM per numero di pozzi in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere un volume uguale di mezzo reagente di trasfezione a ciascun tubo di miscela di DNA plasmide sospeso da DMEM. Dopo un'incubazione da cinque a 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 25 microlitri di miscela di DNA ai pozzi sperimentali appropriati della piastra di coltura cellulare del carcinoma epatocellulare umano a 24 porri per una trasfezione di sei ore nell'incubatore di coltura cellulare.
E alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo di trasfezione con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius integrato con FBS inattivato al calore 10% spogliato di carbone, due l-glutammina millimolare, 1%penicillina streptomicina e ligando per pozzo e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per altre 16-18 ore. La mattina dopo, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzo e attaccare le cellule da ogni pozzo con 100 microlitri di tampone dilisi passiva per pozzo e scuotere vigorosamente con un miscelatore a vortice. Quindi congelare i liscimi cellulari in azoto liquido.
Il giorno del doppio test della luciferasi, agitare i lisati su uno shaker fino a quando la piastra raggiunge la temperatura ambiente e trasferire 10 microlitri di lisato in singoli pozzi di una piastra di plastica bianca da 96 po '. Quindi leggi l'attività della luciferasi di ogni campione di lisato cellulare su un lettore di micropiatte. Il trattamento del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e pACT plasmidi cellule trasfette con 10 estradiolo nanomolare stimola l'attività luciferasi in quanto il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni contiene il dominio funzionale di transattivazione dipendente dal ligando, AF-2.
Una e 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, inducono l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e pACT recettore degli estrogeni del topo alfa EF plasmidi, suggerendo la fattibilità di questa procedura per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni fino a un nanomolare del trattamento estradiolo. Il trattamento con 4-idrossi-tamoxifene non provoca attività luciferasi nel recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e cellule transfette plasmidali pACT, suggerendo che la funzione AF-2 del recettore degli estrogeni alfa non è attivata da questo ligando. Fino a 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, induce l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi, suggerendo che questa procedura è fattibile per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni alfa ligando fino a 10 nanomolare del trattamento con 4-idrossi-tamoxifene.
L'attività dalla combinazione di pBIND e pACT mouse estrogen receptor alpha ligand binding domain expression plasmidi con 4-idrossi-tamoxifene è significativamente superiore alla combinazione di pBIND e pACT umano recettore degli estrogeni alfa ligando legame dominio espressione plasmidi. Ciò indica che l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4 idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo è più potente del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani. Inoltre, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo contenente un dominio F umano è significativamente inferiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo di tipo selvatico.
Al contrario, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani contenente un dominio F del topo è significativamente superiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani di tipo selvatico. Ciò suggerisce che il dominio F ha un'influenza sull'attività di omodimerizzazione del dominio alfa ligando legante alfa legante 4-idrossi-tamoxifene dipendente dalle specie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare l'attività basale del dominio di legame del DNA GAL4 che lega il ligando alfa del recettore degli estrogeni fuso legare l'attività del dominio con il ligando.
Tale attività dovrebbe essere la stessa del trattamento del veicolo.
