La consegna migliorata della convezione, o CED, di vettori virali optogenetici in primati non umani consentirà ai ricercatori di manipolare l'attività neurale su larga scala per comprendere calcoli e comportamenti neurali complessi. Con il CED possiamo ottenere un'alta espressione optogenetica in vaste regioni del cervello dei primati con poche iniezioni in un breve lasso di tempo rispetto ai metodi tradizionali. La risonanza magnetica o l'impianto a camera compatibile con mr viene eseguito utilizzando la pratica standard negli interventi chirurgici di primati non umani, la procedura è descritta in dettaglio nel protocollo di testo e delineata brevemente in questo video.
Dopo la sedazione, il posizionamento e l'incisione iniziale degli animali come descritto nel protocollo di testo, creare una craniotomia circolare per coprire le traiettorie prepianenate per le iniezioni utilizzando una trefina. Creare un'indentazione al centro della craniotomia pianificata sufficientemente profonda nel cranio per ancorare la trefina utilizzando il punto di centraggio regolabile della trefina. Una volta fatto il centro, abbassare la trefina sul cranio e ruotare la trefina in senso orario e antiorario mentre si applica la pressione verso il basso fino a quando il cappuccio osseo non può essere rimosso con le forcep.
Dopo aver sollevato la dura come descritto nel protocollo di testo, tagliare la dura dal centro al bordo della craniotomia e continuare lungo il bordo con forbici oftalmiche fini. Montare la camera cilindrica su misura per la consegna compatibile MR sul cranio sopra la craniotomia per fornire supporto alla cannula durante l'infusione in modo che la curvatura della flangia della camera si allinei bene con la curvatura del cranio. Fissare gli impianti al cranio utilizzando viti di plastica e acrilico dentale o alcune viti in titanio.
Subito dopo aver impiantato la camera compatibile con MR e aver inserito la griglia di iniezione di cannula nella camera, riempire la griglia con lo 0,9% di soluzione salina per visualizzare le posizioni di iniezione tramite immagini anatomiche MR. Riempire anche le cavità della camera con schiuma di gel assorbibile sterile bagnata per mantenere l'umidità del cervello. Coprire la pelle e il cilindro con un drappo incisa antimicrobico sterile per mantenere la sterilità dei cilindri durante il trasporto e le infusioni mr.
Posizionare una capsula di vitamina E per contrassegnare la parte superiore della griglia di iniezione per un'identificazione positiva. Mentre l'animale rimane intubato, staccare il tubo endotracheale dal circuito di anestesia e riattaccarlo a una macchina isoflurana portatile compatibile con MR. Trasportare l'animale allo scanner per risonanza prima della risonanza.
Acquisire immagini T1 per calcolare la distanza dalla parte superiore della griglia di iniezione e dalla superficie corticale. La capsula di vitamina E è chiaramente visibile nelle immagini T1 e deve essere utilizzata come marcatore per la parte superiore della griglia di iniezione. Acquisire immagini T2 per determinare le guide cannula ottimali per ogni sito in base al sito di infusione mirato.
La griglia di cannula è piena di salina che è meglio visibile nelle immagini T2. Utilizzando il software di imaging MR, scorrere i piani coronali e sagittali per trovare la posizione target dell'infusione. Dopo aver scongelato il vettore virale per alcune ore a temperatura ambiente, mescolare il vettore virale con l'agente di contrasto MR gadoteridol per pipetta o miscelazione del vortice.
Caricare il virus misto in tubi IV ad alta pressione da 0,2 millilitri. Utilizzando tubi IV ad alta pressione, collegare una lunga linea di estensione a una siringa da tre millilitri compatibile con MR e prime con soluzione salina. Collegare l'altra estremità del tubo di estensione lungo ai tubi IV da 0,2 millilitri caricati con il virus.
Quindi collegare la cannula resistente al reflusso con una punta a gradini di un millilitro all'estremità distale di questo gruppo con un connettore catetere in stile morsetto. Infine, impostare la siringa in una pompa compatibile con MR. Utilizzando le immagini MR anatomiche di base ottenute, selezionare la posizione della griglia di iniezione della cannula e la profondità di inserimento necessarie per raggiungere il sito di infusione target.
Contrassegnare la profondità di inserimento sulla cannula utilizzando nastro sterile. Iniziare l'infusione ad una velocità di un microlitro al minuto e convalidare visivamente il flusso del fluido nella linea di infusione osservando l'espulsione del fluido dalla punta della cannula. Inserire manualmente la cannula attraverso la griglia di iniezione alla profondità di destinazione mantenendo il flusso nella linea di infusione in quanto ciò impedirà al tessuto penetrato di intasare la cannula durante l'inserimento.
Ora acquisisci immagini veloci ponderate T1 flash per il monitoraggio online dell'infusione vettoriale virale. Dopo aver infuso circa 10 microlitri del vettore in modo tale che un virus sufficiente sia infuso per rilevare nello scanner MR, ottenere immagini MR per verificare il corretto posizionamento della cannula come evidente dalla diffusione osservata del virus. Se la profondità della cannula inserita non è corretta, regolare la profondità di conseguenza o rimuovere lentamente la cannula e reattempt l'inserimento.
Monitora l'infusione tramite la guida di immagini MR online. Aumentare la velocità di infusione a cinque microlitri al minuto di un microliter al minuto ogni pochi minuti. È importante aumentare lentamente il tasso di infusione e non superare cinque microlitri al minuto poiché alti tassi di infusione potrebbero causare danni ai tessuti.
Dopo aver infondere circa 40 microlitri del vettore virale, iniziare a ridurre la velocità di infusione di un microlitro al minuto. Interrompere l'infusione dopo l'iniezione di circa 50 microlitri. Lasciare la cannula in posizione per dieci minuti.
Rimuovere lentamente la cannula dal cervello e spostarsi nella posizione successiva. Coprire il cilindro con un drappo sterile alla fine delle iniezioni prima del trasporto degli animali, quindi trasportare l'animale in sala operatoria. Le analisi istologiche sulle sezioni coronali seriali rivelano un'espressione optogenetica su larga scala intorno ai siti di infusione.
Qui è mostrata l'immagine mr coronale di base e la diffusione dell'agente di contrasto dopo l'infusione per la stessa fetta coronale MR. Una sezione di tessuto coronale è mostrata approssimativamente dalla stessa. La colorazione perossidasi riflette l'espressione della proteina fluorescente gialla o reporter EYFP.
Si osserva un buon allineamento tra l'area di espressione EYFP, misurata con epifluorescenza superficiale e con colorazione istologica. Questi includono la regione di diffusione vettoriale stimata dalle immagini MR. I punti bianchi indicano i siti di iniezione e l'intera regione nera rappresenta l'area esposta dalla craniotomia.
Qui è mostrata un'immagine a basso ingrandimento delle sezioni coronali macchiate con anticorpo anti GFP che mostra l'aspetto laterale mediale dell'espressione YFP nella corteccia somatosensoriale. La punta della freccia nera indica la posizione della traccia di cannula. Il tessuto adiacente è mostrato ad un ingrandimento maggiore per mostrare la distribuzione laminare delle cellule positive YFP.
Le regioni densamente popolate delle cellule positive dell'YFP si trovano prevalentemente negli strati da due a tre e da cinque a sei. Un ulteriore allargamento rivela le tipiche cellule piramidali negli strati da due a tre, strato cinque e livello sei. È importante lasciare la cannula in posizione per 10 minuti dopo che il flusso si è interrotto.
Ciò garantirà che il virus sia percolato nel tessuto neurale mirato circostante. Il CED è un approccio efficiente per raggiungere livelli di espressione uniformemente elevati in grandi regioni cerebrali nei mammiferi. Ha il potenziale per espandere la nostra comprensione dei circuiti neurali e della connettività.
Dopo la trasduzione virale da parte del CED, i successivi esperimenti di stimolazione optogenetica possono essere abbinati a registrazioni elettriche e saggi comportamentali per rivelare la complessa dinamica del circuito all'interno del cervello. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata da Yazdan-Shahmorad e colleghi nel 2018 in cui la modulazione neurale optogenetica è stata utilizzata per indurre cambiamenti di connettività a livello di rete nella corteccia motoria sensoriale.
