La misurazione delle specie reattive dell'ossigeno o ROS è notoriamente problematica. In questo video, dimostreremo la misurazione riproducibile del ROS in risposta al crosslinking del recettore FC-gamma utilizzando sonde fluorescenti e citometria di flusso. I principali vantaggi di questa tecnica sono la riproducibilità del saggio e l'uso di questo metodo con stimoli antigenici specifici, non solo mitogeni o induttori ROS noti.
La produzione di ROS disregolamentata è fondamentale per lo sviluppo di molte malattie come la malattia granulomatosa cronica o la CGD. Misurare con precisione il ROS potrebbe costituire una parte della diagnosi molecolare del CGD. Studiare la produzione di ROS mediata da FC è importante nello studio delle immunodeficienze, come la CGD, ma anche nello studio delle malattie autoimmuni, o malattie neurodegenerative, dove troppo ROS porta allo stress ossidativo e all'infiammazione.
La tempistica del saggio è critica. Consiglierei a qualcuno che prova questo protocollo per la prima volta di prepararsi a fondo e fare un finto esperimento, se possibile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per sottolineare le fasi del saggio che necessitano di particolare attenzione come la tempistica del saggio.
Per iniziare, preparare macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando supporti condizionati come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Dopo aver adescato i macrofagi durante la notte, aspirare il supernatante e lavare le cellule una volta con PBS. Il siero muore di fame le cellule sostituendo i supporti con lo stesso volume di DMEM a basso siero.
Per ogni topo, una piastra verrà trattata con anti-BSA IgG1 mentre il siero muore di fame mentre l'altra non verrà trattata. Aggiungere solo DMEM a basso siero alle piastre non trattate e aggiungere DMEM a basso siero contenente 2,5 microgrammi per millilitro di murina anti-BSA IgG1 alle piastre trattate. Assicurarsi di includere un'ulteriore piastra non trattata per ogni esperimento per fungere da controllo della compensazione citometrica del flusso.
Incubare le piastre quattro ore a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Durante l'incubazione di quattro ore, preparare una soluzione 2X delle sonde reattive delle specie di ossigeno. Per ogni 10 millilitri di DMEM a basso siero necessari, aggiungere quattro microlitri di un reagente di rilevamento delle sollecitazioni ossidativo e quattro microlitri di un reagente di rilevamento del superossido.
Quindi, preparare le soluzioni di sonda 2X contenenti solo il reagente di rilevamento dello stress ossidativo o contenenti solo il reagente di rilevamento del superossido. Dopo l'incubazione di quattro ore, raccogliere le cellule raschiando delicatamente le piastre, raccogliendole in tubi a fondo rotondo etichettati da cinque millilitri. Centrifugare i tubi a 750 volte g per cinque minuti.
Assicurarsi di tenere traccia di quali cellule sono state trattate con murina anti-BSA IgG1. Successivamente, lavare i pellet cellulari con due millilitri di PBS per sbarazzarsi di eventuali anti-BSA residui dalle cellule trattate. Centrifugare i tubi a 750 volte g per cinque minuti.
Quindi, aspirare il PBS e rimorsi il pellet cellulare in 600 microlitri di DMEM a basso siero. Dalla sospensione a celle da 600 microlitri, aliquota 200 microlitri nei tubi a fondo tondo preetichettati da cinque millilitri. Dalle celle non trattate, prendere 200 microlitri per i tubi etichettati non stimolati, 200 microlitri per i tubi etichettati induttore positivo e 200 microlitri per i tubi etichettati incentivo positivo più inibitore.
Quindi, dalle cellule trattate anti-BSA IgG1, prendere 200 microlitri per tubi etichettati FC-gamma receptor crosslinking, e 200 microlitri per tubi etichettati FC-gamma recettore crosslinking più inibitore. Dalle celle non trattate da utilizzare per i controlli di compensazione, prendere 200 microlitri per il tubo etichettato non stimolato, 200 microlitri per il controllo verde più induttore e 200 microlitri per il controllo arancione più induttore. Preparare una soluzione di induttore positivo 2X diluire la piocianina da uno a 100 in ciascuna delle soluzioni di sonda 2X a una concentrazione di 500 micromolari.
Quindi, preparare una soluzione BSA 2X diluendo la soluzione di serie BSA nella soluzione di sonda 2X per ottenere una concentrazione 2X di due microgrammi per millilitro. Prima di iniziare la stimolazione specifica, come il crosslinking del recettore FC-gamma, assicurarsi che tutti i reagenti e le cellule siano pronti e posizionare i tubi sul ghiaccio nell'ordine in cui saranno stimolati. Per i citometri di flusso con un autocampionatore, prendere nota del tempo necessario al citometro per analizzare un campione e passare a quello successivo.
Assicurarsi di includere eventuali passaggi di miscelazione e lavaggio della sonda. La tempistica è molto critica per questo saggio. Affinché ogni condizione sia ben controllata, la stimolazione deve essere eseguita esattamente in 30 minuti per ogni condizione.
Stimolare le cellule in ordine e incorporare il tempo di ritardo tra le acquisizioni di campioni da parte del citometro di flusso. Se si esegue la compensazione manuale a questo punto, stimolare i tubi di controllo da utilizzare per la compensazione aggiungendo 200 microlitri della soluzione di sonda 2X contenenti il reagente di rilevamento delle sollecitazioni ossidativo e l'induttore nei tubi contrassegnati verde più induttore. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione di sonda 2X contenenti il reagente di rilevamento del superossido e l'induttore nei tubi contrassegnati come arancione più induttore.
Incubare le cellule per 30 minuti al buio. Utilizzando il software di citometria a flusso, generare ed etichettare tre file di esempio per il controllo, non macchiati, non trattati, il verde più l'induttore e i campioni arancioni più induttori, assicurandosi di indicare i canali e i parametri da analizzare. Inoltre, inserisci le condizioni di arresto desiderate.
Una volta impostati gli esempi di controllo, generare ed etichettare un insieme simile di file per i campioni sperimentali. Ora, esegui il campione non macchiato e non trattato. Aprite un grafico a punti per la dispersione in avanti sull'asse X rispetto alla dispersione laterale sull'asse Y e disegnate un cancello attorno alle celle di interesse, escluse le cellule morte e i detriti.
Quindi, usate il gate di questa cella per aprire un altro grafico a punti del primo marcatore di fluorescenza, FL1, sull'asse X, rispetto al secondo marcatore di fluorescenza, FL2, sull'asse Y. Disegnare un cancello del quadrante iniziale e quindi regolare il cancello del quadrante in modo che gli eventi appaiano nel quadrante in basso a sinistra del plottaggio FL1 contro FL2. Al termine, eseguire il campione verde più induttore.
Regolate la tensione in modo che gli eventi appaiano nei quadranti inferiore sinistro e destro del plottaggio FL1 contro FL2. Quindi, applicare questa matrice di compensazione a tutti e tre i file di esempio. Ora, esegui il campione arancione più induttore.
Regolate la tensione in modo che gli eventi appaiano sui quadranti superiore e inferiore sinistro del plottaggio FL1 contro FL2, quindi applicate questa matrice di compensazione a tutti e tre i file campione. Controllare ogni file di compensazione e assicurarsi che gli eventi non contaminati e non trattati vengano visualizzati nel quadrante in basso a sinistra, gli eventi verde più induttore vengano visualizzati nei quadranti inferiore sinistro e destro e gli eventi arancioni più induttori vengano visualizzati sui quadranti superiore e inferiore sinistro del plottaggio FL1 contro FL2. Quindi, applicare la matrice di compensazione a tutti i file di esempio sperimentali.
Una volta eseguita la compensazione manuale ed ottenuto un modello sperimentale, passare ai campioni sperimentali. Prima di trattare le cellule con un induttore positivo o condurre la stimolazione cellulare del recettore FC-gamma, contrassegnare quali tubi avranno un inibitore del ROS. Trattare queste cellule con l'inibitore del ROS almeno 30 minuti prima della stimolazione positiva dell'induttore o del recettore FC-gamma aggiungendo un microlitro dell'inibitore a 200 microlitri di cellule rimescolate per una concentrazione finale di cinque millimolare.
Per le cellule non stimolate, trattare le cellule con 200 microlitri della soluzione di sonda 2X senza alcuno stimolo aggiunto ai 200 microlitri di sospensione cellulare etichettati macchiati, non stimolati. Per i controlli positivi, trattare le cellule con 200 microlitri della soluzione di induttore positivo 2X a 200 microlitri di sospensione cellulare etichettati induttore positivo o induttore positivo più inibitore. Infine, per le cellule stimolate dal crosslinking del recettore FC-gamma, trattarle con 200 microlitri della soluzione 2X BSA aggiunti a 200 microlitri della sospensione cellulare etichettati FC-gamma receptor crosslinking o FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor.
Incubare le cellule per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, analizzare i campioni nell'ordine in cui sono stati stimolati, utilizzando il citometro di flusso e i modelli di analisi generati durante le fasi iniziali di compensazione. I dati qui riportati dimostrano il rilevamento citometrico del flusso della produzione reattiva di specie di ossigeno risultante dalla stimolazione dei macrofagi attraverso il recettore FC-gamma.
C'è un marcato aumento della fluorescenza FL1 e FL2 quando le cellule vengono stimolate con l'agente reticolo del recettore FC-gamma. Quando le cellule sono state trattate con l'inibitore reattivo della specie di ossigeno prima del collegamento incrociato del recettore FC-gamma, questa maggiore fluorescenza viene riportato a livelli basali. Al contrario, questi grafici a punti presentano un esperimento fallito, in cui è stata osservata la produzione di specie reattive non ottimale delle specie di ossigeno a seguito della stimolazione del recettore FC-gamma.
Per evidenziare le grandi differenze tra le percentuali previste o aumenti delle IFM, questi dati mostrano l'aspetto dei campioni con un aumento minimo della fluorescenza FL1 e FL2. Il protocollo corrente utilizza un passaggio di adescamento 24 ore su 24. Quando si confronta un tempo di adescamento di 24 ore rispetto a un tempo di adescamento di 48 ore, non c'era alcuna differenza marcata nella percentuale di cellule positive per il reagente di sollecitazione ossidativo verde.
Tuttavia, l'aumento del tempo di adescamento a 48 ore ha aumentato la percentuale di cellule positive per la fluorescenza arancione. Le cose più importanti da ricordare quando si esegue questa procedura è pianificare in anticipo ed essere coerenti sulla tempistica del saggio per ottenere risultati riproducibili.
