Drosophila funge da buon sistema modello per lo studio della funzione mitocondriale. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della sintasi citrato nell'omogeneato tissutale dalle mosche adulte. Questo protocollo non richiede l'isolamento dei mitocondri.
È veloce e semplice ed è adatto per misurare l'attività della sintasi citrato nelle larve, nelle cellule coltivate e nei tessuti dei mammiferi. Inizia raccogliendo mosche adulte per ogni campione, assicurandoti di raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo. Preparare 500 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato con HEPES da 20 millimolare, UN EDTA millimolare e 0,1% tritone X-100 in una provetta da 1,5 millilitri per ogni campione.
Anestetizza le mosche adulte con anidride carbonica su un tampone di anestesia. Per isolare i torace, fissarli con un paio di forcep e isolare gli addome di mosca tagliando lungo il bordo del torace e dell'addome con un paio di forbici. Raccogliere i torace di mosca per il saggio di attività della sintasi citrato.
Trasferire immediatamente 10 torace di mosca adulto in 100 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato e omogeneizzarli con un pestello sul ghiaccio. Mantenere i campioni freddi omogeneizzando per cinque o 10 secondi sul ghiaccio, lasciandoli sedere sul ghiaccio per cinque secondi, per poi ripetersi fino a quando tutti i tessuti non sono completamente omogeneizzati. Aliquot 10 microlitri di ogni campione omogeneizzato in un nuovo tubo per la misurazione del contenuto proteico, mantenendo questi tubi anche sul ghiaccio.
Aggiungere 400 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato-freddo a ciascun campione rimanente per un volume totale di 500 microlitri e pipetta su e giù delicatamente da mescolare. Per ogni reazione, aggiungere un microlitro di litolato di cellule diluite a 150 microlitri della soluzione di reazione preparata al momento. Mescolare accuratamente pipettando delicatamente, assicurandosi di evitare la formazione di bolle, quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 412 nanometri ogni 10-30 secondi per quattro minuti a 25 gradi Celsius.
Tracciate i dati come assorbanza nel tempo, quindi calcolate la pendenza per la porzione lineare della curva. Infine, dividere la velocità di reazione o la pendenza per la concentrazione proteica del campione per normalizzare l'attività sintasi del citrato. È stato ipotizzato che il knockdown di dRNF34 nel muscolo Drosophila aumenterebbe l'attività della sintasi del citrato mitocondriale mentre il knockdown del dPGC-1 avrebbe invertito questo aumento.
Per ogni saggio è stato stabilito un tasso enzimatico lineare iniziale; Le attività massime del citrato sintasi sono state calcolate dalle curve cinetiche e normalizzate dalla concentrazione proteica. I risultati hanno dimostrato che l'attività sintasi dei torace di mosca è effettivamente aumentata con il knockdown dRNF34 specifico del muscolo e l'aumento è stato invertito dal knockdown dPGC-1 specifico del muscolo.
Quando si omogeneizza il campione, è importante puntare il tubo e controllare l'omogeneato per assicurarsi che non ci siano coaguli e che i tessuti nel tubo siano completamente omogeneizzati. Dopo la raccolta del campione, tutti i trattamenti campione devono essere eseguiti sul ghiaccio. Il saggio di attività della sintasi citrato è usato per quantificare la massa mitocondriale intatta.
Una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale.
