Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città. 1. Configurazione hardware e software <ol><li> Due fotoni configurazione microscopio a scansione: <ol><li> Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso &lt;120 fsec). </li><li> Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. Nota: questo permette un frame rate di 40 o 60 Hz a 750 x 400 pixel. Un frame rate elevato è fondamentale per ridurre al minimo il movimento del cervello distorsione dell&#39;immagine indotta. Inoltre, i risultati di scansione veloce di risonanza in un rendimento superiore del segnale e riduce photobleaching 16 e fototossicità. </li><li> Utilizzare una velocità elevata z-stepper piezo-elettrico in sequenza le immagini intercalati tempo acquisiscono a più profondità. Nota: Questo è opzionale e utilizzato per aumentare la resa dei dati a scapito del frame rate. </li><li> Utilizzare amblanker eccanico per ridurre l&#39;esposizione laser al tessuto. Regolare la larghezza della blanker funzione dell&#39;ampiezza dello scanner risonante Nota:. Causa della natura sinusoidale del percorso di scansione di uno scanner di risonanza, il raggio laser si muove invece lento nei punti di consegna di scansione. Per evitare danni del tessuto in questi punti di consegna in cui l&#39;esposizione laser è maggiore, un blanker meccanico viene introdotto nel piano focale tra la scansione e lenti tubo che interrompe il fascio laser. </li><li> Per l&#39;acquisizione dei dati utilizzare un digitalizzatore ad alta velocità (800 MHz) in combinazione con una matrice di field-programmable gate (FPGA). Nota: I filtri passa-alto FPGA e cestini il segnale PMT in pixel. La combinazione del filtro passa-alto sul FPGA e il filtro passa-basso effetto il risultato amplificatore PMT in un filtro passa-banda centrato approssimativamente intorno alla frequenza di ripetizione del laser (80 MHz). Esempio di codice FPGA viene fornito come supplemento. </li></ol></li><li> Impostazione tapis roulant Air supportato basato sul disegno di Dombeck e colleghi 2 <ol><li> Collegare il titolare palla per una linea di alimentazione dell&#39;aria utilizzando un tubo di alimentazione di aria di almeno 10 mm di diametro interno. Massimizzare la sezione del bocchettone di rifornimento dell&#39;aria portapalline e posizionare ampie quantità di tubazione tra l&#39;alimentazione dell&#39;aria principale e la porta pallina Nota:. Aumento sezione trasversale e una maggiore lunghezza del tubo di alimentazione dell&#39;aria riduce la generazione di rumore. </li><li> Mettere una pallina di polistirolo espanso (diametro 20 cm) in un supporto palla custom-designed e 3D-stampati. </li><li> Se il paradigma comportamentale richiede solo avanti (e indietro) locomozione, limitare il movimento della sfera e la (pitch) asse orizzontale inserendo un perno (ad esempio un ago ipodermico G 19) sul lato della palla Nota:. Tipicamente animali si adattano alle l&#39;installazione molto più veloce in questo paradigma di rotazione ridotta. </li><li> Traccia movimento della palla con una o due mouse per computer otticiper rilevare il movimento intorno a due o tutti e tre gli assi, rispettivamente. Nota: I mouse per computer dovrebbe idealmente operare con un diodo ad infrarossi per almeno interferenze con il imaging. </li></ol></li><li> Impostazione ambiente di realtà virtuale <ol><li> Preparare l&#39;ambiente di realtà virtuale. Nota: Un ambiente campione basato su Panda3D, un motore di gioco liberamente disponibile, è fornito come supplemento. Gli oggetti dell&#39;ambiente virtuale vengono generati utilizzando Wings3D, un modellatore 3D open source. Il programma di esempio legge le informazioni di posizione su una scheda di acquisizione dati e questo si traduce in movimento in un ambiente virtuale. Il codice esegue la trasformazione non lineare necessaria per l&#39;ambiente da proiettare su uno schermo toroidale. La costruzione dettagliata della schermata toroidale è stato descritto altrove 14,17. </li><li> Utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per la visualizzazione di un ambiente virtuale. Integrare un circuito gatingCUIT per un veloce sfarfallio dei LED durante l&#39;imaging. Nota: Un problema inerente a due fotoni di imaging durante la stimolazione visiva è perdita di luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva, che può essere ridotto schermando l&#39;obiettivo. Tuttavia, leggera perdita dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente abolita sincronizzando l&#39;emissione di luce del proiettore ai punti di consegna dello scanner di risonanza (quando i dati non vengono acquisiti), come si fa con arene LED utilizzati per la stimolazione visiva durante l&#39;imaging in Drosophila 18. Ciò si traduce in un efficace alternanza alta velocità di stimolazione visiva e acquisizione dati (vedere la Figura 2). La frequenza di sfarfallio (24 kHz) è ordini di grandezza superiori alla soglia sfarfallio di fusione, dal quale sfarfallio non è più percepito dall&#39;animale. Lo schema del circuito elettronico di questa modifica a un proiettore commerciale LED è mostrato in Figura 3. </li></ol></li><li> Cuccioloil monitoraggio <ol><li> Utilizzare una videocamera basata CMOS (30 fps) per il rilevamento di posizione della pupilla. Assicurarsi che la fotocamera non contiene un filtro di blocco infrarossi. Nota: L&#39;allievo è visibile ad alto contrasto durante le registrazioni a causa della luce diffusa dal laser di eccitazione a due fotoni in uscita attraverso l&#39;occhio. Posizione della pupilla e diametro viene estratto in tempo reale utilizzando software programmato personalizzato basato sul disegno di Sakatani e Isa 19. </li></ol></li></ol> 2. Iniezione di calcio genetica Indicator e la finestra Implant L&#39;iniezione di un indicatore di calcio 20 e l&#39;impianto della finestra cranica 21 vengono eseguiti come precedentemente descritto con le seguenti aggiunte: <ol><li> Iniettare il virus nella regione di interesse utilizzando una pipetta di iniezione vetro ripiena con soluzione virus e collegato ad un sistema di iniezione a pressione. Regolare la pressione in funzione della pipetta interna-diametro, tipicamente ca. 70-140 mbar, per iniettare circa 100 nl di soluzione virus nel corso di 1-2 min. Impulsi di iniezione basso volume erogato a bassa frequenza (0,05 sec impulsi a 2 Hz) dovrebbero essere utilizzati al fine di evitare overflow del virus lungo la pipetta durante l&#39;iniezione. Nota: Al fine di controllare il volume di iniezione, la pipetta può essere marcato in piccola , lunghezze equidistanti (ad esempio 0,5 millimetri) sotto un microscopio stereo. Spostamento del menisco tra le marcature può quindi essere utilizzato per stimare il volume iniettato. </li><li> Diversi iniezione settimane dopo ciò dovrebbe comportare un bolo di cellule densamente marcate con un diametro di circa 500 micron. Efficacia di espressione GECI nella regione di interesse dipende dalla scelta di GECI e combinazione promotore, così come il titolo infettivo e sierotipo di AAV ricombinante usato Nota:. Come esempio rappresentativo, iniezione di AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una tetta viraleer di 8 x 10 12 GC / ml nella corteccia visiva primaria del mouse comporta espressioni soddisfacente a circa due settimane dopo l&#39;iniezione (Figura 1). </li><li> La barra testa non deve ostacolare il campo visivo del mouse, ma deve essere sufficientemente rigido per consentire l&#39;imaging stabile durante il comportamento. Ciò richiede in genere due punti di attacco su entrambi i lati della barra di testa (vedi figura 1). Per fissare saldamente la barra testa al cranio, assicurarsi di massimizzare e asciugare la zona del cranio esposto in cui sarà allegata la barra testa. Inoltre, utilizzando un bisturi o una siringa, graffiare il cranio per creare scanalature superficiali aumentando così la superficie di incollaggio. Coprire l&#39;osso con tessuto adesivo cianoacrilato prima di fissare la barra testa con cemento dentale. </li></ol> 3. Procedura sperimentale <ol><li> Due o tre settimane dopo l&#39;iniezione del virus, controllare la finestra di impianto craniale per chiarezza e di espressione in epiilluminazione a fluorescenza. Confini chiaramente visibili e ben definiti dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l&#39;impianto finestra è adatto per l&#39;imaging (vedere Figura 1). </li><li> Misurare e regolare la potenza del laser ad un valore inferiore a 50 mW a campione. </li><li> Accendere il flusso d&#39;aria per il tapis roulant sferica. </li><li> Per il fissaggio testa sotto il microscopio, brevemente anestetizzare l&#39;animale con isoflurano per ridurre lo stress. Posto l&#39;animale in un contenitore anestesia isoflurano e attendere che le fermate degli animali in movimento (circa 10 sec). Rimuovere l&#39;animale e subito la testa fissarlo sotto il microscopio. </li><li> Posizionare il sistema di visualizzazione più vicino possibile all&#39;animale per consentire ancora per l&#39;accesso agli animali. Il contatto visivo meno l&#39;animale ha con lo sperimentatore, il meno stressato l&#39;animale sarà durante la fase iniziale dell&#39;esperimento. </li><li> Assicurarsi che la finestra di protesi cranica è libero di polvere e sporcizia. Pulire con acquase necessario. </li><li> Applicare il gel trasparente ultrasuoni come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l&#39;obiettivo di acqua-immersion. Questo risolve i problemi di lenta degradazione dell&#39;immagine dovuta all&#39;evaporazione di acqua o perdite e riduce la necessità di montare un cono sulla barra testa di trattenere l&#39;acqua. Nota: Centrifugare il gel prima dell&#39;uso per rimuovere tutte le bolle d&#39;aria, e fare attenzione a non creare l&#39;aria bolle durante l&#39;applicazione del gel. Le bolle d&#39;aria possono ridurre notevolmente la qualità dell&#39;immagine. </li><li> Avvolgere un pezzo di nastro adesivo nero attorno al bar oggettiva e la testa per la schermatura della luce. </li><li> Spostare l&#39;arena ambiente virtuale nella sua posizione definitiva e regolare la telecamera per il monitoraggio degli alunni. </li><li> Impostare la blanker laser per abbinare l&#39;ampiezza di scansione utilizzata durante l&#39;esperimento. </li><li> Avviare la registrazione dei dati. </li></ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning.">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li><li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., H&#252;bener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse.">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li><li>Akerboom, J., Chen, T. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging.">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li><li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2++indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li><li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li><li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes.">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li><li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging.">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li><li>Margolis, D. J., L&#252;tcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation.">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li><li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo.">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li><li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation.">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li><li>H&#246;lscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments.">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li><li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRT+letter:+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching).">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li><li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+Reality+for+Mice,+mousevr.blogspot.com.">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li><li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL/6+mice.">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li><li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2/3+of+mice.">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li><li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Schmidt-Hieber, C., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex.">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi: <ol><li> Nel corso della finestra giorni dopo l&#39;impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging. </li><li> Durante l&#39;esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativ...

Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell&#39;attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell&#39;attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo. È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l&#39;imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante<html> siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l&#39;accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l&#39;attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l&#39;imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l&#39;imaging cronica fino a diversi mesi dopo l&#39;intervento. Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l&#39;imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il 14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate 6. t &quot;&gt; Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l&#39;ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l&#39;imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="653">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">cover slips (d = 3-5 mm)</td>
			<td style="width:151px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">window implant</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">InSight DeepSee laser</td>
			<td>Spectra-Physics</td>
			<td></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12kHz resonance scanner</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G1-003-30026</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Galvometer</td>
			<td>Cambridge Technology</td>
			<td>G6215H</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI 5772</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FPGA</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PXIe 7965R</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCIe 6363</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emission filter 525/50</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF03-525/50-25</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piezo-electric z-drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>P-726.1CD</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Controller for piezo-electric drive</td>
			<td>Physikinstrumente</td>
			<td>E665 LVPZT</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI75</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Current amplifier</td>
			<td style="width:151px;">Femto</td>
			<td style="width:119px;">DHPCA-100</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Photomultiplier tube</td>
			<td style="width:151px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">USB Camera without IR filter</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>DMK22BUC03&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Objective 50 mm</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>M5018-MP&#160;</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Macro adapter rings</td>
			<td>ImagingSource</td>
			<td>LAexSet</td>
			<td>pupil tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical computer mouse</td>
			<td>Logitech</td>
			<td>G500</td>
			<td>motion tracking</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Styrofoam ball 20 cm</td>
			<td>e.g. idee-shop.de</td>
			<td>08797.00.15</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LED projector</td>
			<td>Samsung</td>
			<td>SP-F10M&#160;</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI 6009</td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Panda3D game engine</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Numpy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scipy library for Python</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">NI-DAQmx driver</td>
			<td style="width:151px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td>
			<td>virtual environment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:151px;">Dahlhausen</td>
			<td style="width:119px;">5701.0342.10</td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in mice navigating a virtual reality environment

Negli ultimi anni, l&#39;imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l&#39;animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l&#39;imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l&#39;indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l&#39;ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.

La qualità dell&#39;immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l&#39;iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito....

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Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.

Due fotoni Imaging di calcio in topi Navigazione una realtà ambiente virtuale

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

30.8K Views.  Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research.  Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale. 

Video: Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Development of a Virtual Reality Assessment of Everyday Living Skills

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; Treatment studies aimed at cognitive impairment in patients with schizophrenia not only require demonstration of improvements on cognitive tests, but also evidence that any cognitive changes lead to clinically meaningful improvements.&#160; Measures of &#8220;functional capacity&#8221; index the extent to which individuals have the potential to perform skills required for real world functioning. &#160;Current data do not support the recommendation of any single instrument for measurement of functional capacity.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is a novel, interactive gaming based measure of functional capacity that uses a realistic simulated environment to recreate routine activities of daily living. Studies are currently underway to evaluate and establish the VRFCAT&#8217;s sensitivity, reliability, validity, and practicality.&#160;This new measure of functional capacity is practical, relevant, easy to use, and has several features that improve validity and sensitivity of measurement of function in clinical trials of patients with CNS disorders.

A challenge for proving treatment efficacy for cognitive impairments in schizophrenia is finding the optimizing measurement of skills related to everyday functioning.&#160; The Virtual Reality Functional Capacity Assessment Tool (VRFCAT) is an interactive gaming based computerized measure aimed at skills associated with everyday functioning, including baseline impairments and treatment related changes.

Sviluppo di una Realtà Virtuale valutazione della vita quotidiana Skills

Cognitive impairments affect the majority of patients with schizophrenia and these impairments predict poor long term psychosocial outcomes.&#160; ...

Ricerca

Comportamento

A Protocol for Housing Mice in an Enriched Environment

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent studies demonstrate that environmental enrichment decreases adiposity, increases energy expenditure, resists diet induced obesity, and causes cancer remission and inhibition in mice. EE typically consists of larger living space, a variety of &#8216;toys&#8217; to interact with, running wheels, and can include a number of other novel environmental changes. All of this fosters a more complex social engagement, cognitive and physical stimulations. Importantly, the toy location and type of toy is changed regularly, which encourages the mice to adapt to a frequently changing and novel environment. Many variables can be manipulated in EE to promote health effects in mice. Thus these approaches are difficult to control and must be properly managed to successfully replicate the associated phenotypes. Therefore, the goal of this video is to demonstrate how EE is properly set up and maintained to assure a complex, challenging, and controlled environment so that other researchers can easily reproduce the protective effects of EE against obesity and cancer.

Environmental enrichment for mice requires a complex and challenging setup, as well as comprehensive husbandry and handling techniques to assure robust metabolic and anti-cancer effects in the mice. This protocol provides detailed procedures to reproduce the above mentioned effects in mice.

Un protocollo per Mice Housing in un ambiente arricchito

Environmental enrichment (EE) is a housing environment for mice that boosts mental and physical health compared to standard laboratory housing. Our recent ...

Multifunctional Setup for Studying Human Motor Control Using Transcranial Magnetic Stimulation, Electromyography, Motion Capture, and Virtual Reality

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular function include transcranial magnetic stimulation, electromyography, and three-dimensional motion capture. The advent of readily available and cost-effective virtual reality solutions has expanded the capabilities of researchers in recreating &#8220;real-world&#8221; environments and movements in a laboratory setting. Naturalistic movement analysis will not only garner a greater understanding of motor control in healthy individuals, but also permit the design of experiments and rehabilitation strategies that target specific motor impairments (e.g. stroke). The combined use of these tools will lead to increasingly deeper understanding of neural mechanisms of motor control. A key requirement when combining these data acquisition systems is fine temporal correspondence between the various data streams. This protocol describes a multifunctional system&#8217;s overall connectivity, intersystem signaling, and the temporal synchronization of recorded data. Synchronization of the component systems is primarily accomplished through the use of a customizable circuit, readily made with off the shelf components and minimal electronics assembly skills.

Transcranial magnetic stimulation, electromyography, and 3D motion capture are commonly used non-invasive techniques for investigating neuromuscular function in humans. In this paper, we describe a protocol that synchronously samples data generated by all three of these tools along with the unique addition of virtual reality stimulus presentation and feedback.

Impostazione multifunzionale per lo studio di controllo del motore umano Utilizzando la Stimolazione Magnetica Transcranica, Elettromiografia, Motion Capture, e la realtà virtuale

The study of neuromuscular control of movement in humans is accomplished with numerous technologies. Non-invasive methods for investigating neuromuscular ...

Using Virtual Reality to Transfer Motor Skill Knowledge from One Hand to Another

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by observation or passive movement of trainee&#39;s hands by a robotic device). This obviously presents a major challenge in the rehabilitation of a paretic limb since voluntary control of physical movement is limited. Here, we describe a novel training scheme we have developed that has the potential to circumvent this major challenge. We exploited the voluntary control of one hand and provided real-time movement-based manipulated sensory feedback as if the other hand is moving. Visual manipulation through virtual reality (VR) was combined with a device that yokes left-hand fingers to passively follow right-hand voluntary finger movements. In healthy subjects, we demonstrate enhanced within-session performance gains of a limb in the absence of voluntary physical training. Results in healthy subjects suggest that training with the unique VR setup might also be beneficial for patients with upper limb hemiparesis by exploiting the voluntary control of their healthy hand to improve rehabilitation of their affected hand.

We describe a novel virtual-reality based setup which exploits voluntary control of one hand to improve motor-skill performance in the other (non-trained) hand. This is achieved by providing real-time movement-based sensory feedback as if the non-trained hand is moving. This new approach may be used to enhance rehabilitation of patients with unilateral hemiparesis.

Utilizzo di realtà virtuale per trasferire conoscenza motoria da un lato a altro

As far as acquiring motor skills is concerned, training by voluntary physical movement is superior to all other forms of training (e.g. training by ...

Mobile Game-based Virtual Reality Program for Upper Extremity Stroke Rehabilitation

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. Game-based therapy can promote patients&#39; engagement in rehabilitation therapy as a more interesting and a motivating tool. Mobile devices such as smartphones and tablet PCs can provide personalized home-based therapy with interactive communication between patients and clinicians. In this study, a mobile VR upper extremity rehabilitation program using game applications was developed. The findings from the study show that the mobile game-based VR program effectively promotes upper extremity recovery in patients with stroke. In addition, patients completed two weeks of treatment using the program without adverse effects and were generally satisfied with the program. This mobile game-based VR upper extremity rehabilitation program can substitute for some parts of the conventional therapy that are delivered one-on-one by an occupational therapist. This time-efficient, easy to implement, and clinically effective program would be a good candidate tool for tele-rehabilitation for upper extremity recovery in patients with stroke. Patients and therapists can collaborate remotely through these e-health rehabilitation programs while reducing economic and social costs.

Here, we present a protocol to develop and apply a mobile game-based virtual reality program for the recovery of upper limb dysfunction in patients with stroke. The present study shows that the mobile program is feasible and effectively promotes upper limb recovery in stroke patients.

Programma di realtà virtuale basato su gioco mobile per riabilitazione del colpo dell'arto superiore

Stroke rehabilitation requires repetitive, intensive, goal-oriented therapy. Virtual reality (VR) has the potential to satisfy these requirements. ...

A Method to Study Adaptation to Left-Right Reversed Audition

An unusual sensory space is one of the effective tools to uncover the mechanism of adaptability of humans to a novel environment. Although most of the previous studies have used special spectacles with prisms to achieve unusual spaces in the visual domain, a methodology for studying the adaptation to unusual auditory spaces has yet to be fully established. This study proposes a new protocol to set-up, validate, and use a left-right reversed stereophonic system using only wearable devices, and to study the adaptation to left-right reversed audition with the help of neuroimaging. Although individual acoustic characteristics are not yet implemented, and slight spillover of unreversed sounds is relatively uncontrollable, the constructed apparatus shows high performance in a 360&#176; sound source localization coupled with hearing characteristics with little delay. Moreover, it looks like a mobile music player and enables a participant to focus on daily life without arousing curiosity or drawing attention of other individuals. Since the effects of adaptation were successfully detected at the perceptual, behavioral, and neural levels, it is concluded that this protocol provides a promising methodology for studying adaptation to left-right reversed audition, and is an effective tool for uncovering the adaptability of humans to a novel environments in the auditory domain.

The present study proposes a protocol to investigate the adaptation to left-right reversed audition achieved only by wearable devices, using neuroimaging, which can be an effective tool for uncovering the adaptability of humans to a novel environment in the auditory domain.

Un metodo per studiare l'adattamento a sinistra-destra invertita Audition

An unusual sensory space is one of the effective tools to uncover the mechanism of adaptability of humans to a novel environment. Although most of the ...

Measuring the Kinematics of Daily Living Movements with Motion Capture Systems in Virtual Reality

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based assessments of IADL are easy to use but prone to subjective bias. Here, we describe a novel virtual reality (VR) test to assess two complex IADL tasks: handling financial transactions and using public transportation. While a participant performs the tasks in a VR setting, a motion capture system traces the position and orientation of the dominant hand and head in a three-dimensional Cartesian coordinate system. Kinematic raw data are collected and converted into &#39;kinematic performance measures,&#39; i.e., motion trajectory, moving distance, and time to completion. Motion trajectory is the path of a particular body part (e.g., dominant hand or head) in space. Moving distance refers to the total distance of the trajectory, and time to completion is how long it took to complete an IADL task. These kinematic measures could discriminate patients with cognitive impairment from healthy controls. The development of this kinematic measuring protocol allows detection of early IADL-related cognitive impairments.

We designed a virtual reality test to assess instrumental activities of daily living (IADL) with a motion capture system. We propose a detailed kinematic analysis to interpret the participant&#39;s various movements, including trajectory, moving distance, and time to completion to evaluate IADL capabilities.

Misura della cinematica dei movimenti di vita quotidiana con sistemi di Motion Capture in realtà virtuale

The inability to complete instrumental activities of daily living (IADL) is a precursor to various neuropsychological diseases. Questionnaire-based ...

A Networked Desktop Virtual Reality Setup for Decision Science and Navigation Experiments with Multiple Participants

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and spatial cognition. With a local area network and dedicated software platform, experimenters can efficiently monitor the behavior of the participants that are simultaneously immersed in a desktop virtual environment and digitalize the collected data. These capabilities allow for experimental designs in spatial cognition and navigation research that would be difficult (if not impossible) to conduct in the real world. Possible experimental variations include stress during an evacuation, cooperative and competitive search tasks, and other contextual factors that may influence emergent crowd behavior. However, such a laboratory requires maintenance and strict protocols for data collection in a controlled setting. While the external validity of laboratory studies with human participants is sometimes questioned, a number of recent papers suggest that the correspondence between real and virtual environments may be sufficient for studying social behavior in terms of trajectories, hesitations, and spatial decisions. In this article, we describe a method for conducting experiments on decision-making and navigation with up to 36 participants in a networked desktop virtual reality setup (i.e., the Decision Science Laboratory or DeSciL). This experiment protocol can be adapted and applied by other researchers in order to set up a networked desktop virtual reality laboratory.

This paper describes a method for conducting multi-user experiments on decision-making and navigation using a networked computer laboratory.

Un'installazione in rete di realtà virtuale Desktop per decisione scienza ed esperimenti di navigazione con più partecipanti

Investigating the interactions among multiple participants is a challenge for researchers from various disciplines, including the decision sciences and ...

Virtual Reality Experiments with Physiological Measures

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and laboratory experiments, respectively. VR is especially useful for geographic visualizations and investigations of spatial behavior. In spatial behavior research, VR provides a platform for studying the relationship between navigation and physiological measures (e.g., skin conductance, heart rate, blood pressure). Specifically, physiological measures allow researchers to address novel questions and constrain previous theories of spatial abilities, strategies, and performance. For example, individual differences in navigation performance may be explained by the extent to which changes in arousal mediate the effects of task difficulty. However, the complexities in the design and implementation of VR experiments can distract experimenters from their primary research goals and introduce irregularities in data collection and analysis. To address these challenges, the Experiments in Virtual Environments (EVE) framework includes standardized modules such as participant training with the control interface, data collection using questionnaires, the synchronization of physiological measurements, and data storage. EVE also provides the necessary infrastructure for data management, visualization, and evaluation. The present paper describes a protocol that employs the EVE framework to conduct navigation experiments in VR with physiological sensors. The protocol lists the steps necessary for recruiting participants, attaching the physiological sensors, administering the experiment using EVE, and assessing the collected data with EVE evaluation tools. Overall, this protocol will facilitate future research by streamlining the design and implementation of VR experiments with physiological sensors.

Virtual reality (VR) experiments can be difficult to implement and require meticulous planning. This protocol describes a method for the design and implementation of VR experiments that collect physiological data from human participants. The Experiments in Virtual Environments (EVE) framework is employed to accelerate this process.

Esperimenti di realtà virtuale con misure fisiologiche

Virtual reality (VR) experiments are increasingly employed because of their internal and external validity compared to real-world observation and ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...