Questo protocollo presenta un flusso di lavoro PCR a goccia multiplex flessibile che consente un conteggio preciso dei leucociti differenziali basato su marcatori di metilazione epigenetica. Questa flessibilità può facilitare la traduzione di mdPCR verso l'uso clinico. Questo metodo fornisce risultati che interrogano attentamente quelli ottenuti utilizzando metodi di colorazione immunofluorescenti.
A differenza della colorazione immunofluorescente, tuttavia, questo metodo non richiede campioni di sangue fresco o anticorpi costosi. Nella diagnostica ematologica, il leucocita differenziale può servire come indicatori per uno spettro di malattie, tra cui infezione, infiammazione, anemia e leucemia, ed è considerato come un biomarcatore precoce del cancro prognostico. A dimostrare la procedura con Abdelrahman Elmanzalawy sarà Christina Nassif, responsabile tecnico del nostro team presso il Medical Device Research Centre di NRC.
Iniziare mescolando accuratamente 20 microlitri di protein chinasi K e 400 microlitri di tampone legante di lisi contenenti perline magnetiche con cellule mononucleari del sangue periferico umano appena scongelate in 100 microlitri di PBS. Dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, posizionare il tubo su un rack magnetico per uno o due minuti prima di rimuovere il supernatante. Con il tubo rimosso dal magnete, sospendere di nuovo il complesso di perline di DNA in 600 microlitri di tampone di lavaggio uno per rimuovere eventuali perline non specificamente legate.
Riposizionare il tubo sul magnete per consentire la rimozione del supernatante, prima di lavare le celle in 600 microlitri di tampone di lavaggio due come appena dimostrato. Dopo aver rimosso il supernatante, lasciare asciugare il tubo all'aria sul magnete per un minuto prima di aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione al tubo con miscelazione accurata. Quindi, posizionare il tubo sul rack magnetico per uno o due minuti per separare le perline magnetiche dal DNA alluso e trasferire la soluzione di DNA purificato in un nuovo tubo.
Per la conversione della bisolfito del DNA purificato, trasferire 20 microlitri del campione di DNA alluso in un tubo PCR e aggiungere 130 microlitri di reagente di conversione al tubo. Dopo un'accurata miscelazione, far girare brevemente il contenuto del tubo e amplificare il DNA su un ciclore termico. Alla fine del ciclo, aggiungere 600 microlitri di tampone legante a una colonna di cromatografia ionica posta in un tubo di raccolta e aggiungere il DNA alla colonna.
Invertire il tubo più volte per mescolare e centrifugare per 30 secondi a tutta velocità. Scartare il flusso raccolto e aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna. Centrifugare la colonna e scartare nuovamente il flusso come dimostrato.
Aggiungere 200 microlitri di Desulfonation Buffer alla colonna per un'incubazione da 15 a 20 minuti a temperatura ambiente, prima di centrifugare il campione e scartare il flusso-through come dimostrato. Quindi, lavare la colonna due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, trasferire la colonna su un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri e aggiungere 100 microlitri di acqua di grado PCR alla membrana della colonna.
Quindi, elutare il DNA centrifugando la colonna per un minuto a tutta velocità. Per la generazione di goccioline, mescolare un microlitro di DNA convertito con bisolfito con un mix di master di sonda appena preparato in un tubo PCR e raccogliere il campione con una breve centrifugazione. Utilizzare raccordi di picco per collegare tubi fluidici usa e getta a due siringhe in vetro di precisione a volume da 250 microliter.
E pre-riempire una siringa di vetro di precisione con 250 microlitri di olio vettore contenente il 5% di tensioattivi flouro e una siringa di vetro di precisione con 50 microlitri di olio vettore. Quando entrambe le siringhe sono state caricate, caricare 100 microlitri del PCR mescolare nella siringa dell'olio portante e posizionare un dispositivo microfluidico a goccia sullo stadio di un microscopio a luce verticale dotato di una telecamera ad alta velocità. Per l'osservazione e la registrazione della formazione di goccioline in tempo reale, posizionare le siringhe preriempita su una pompa di siringhe programmabile e utilizzare l'unione di picco con i raccordi per collegare il tubo delle siringhe al tubo dei rispettivi canali di ingresso del dispositivo microfluidico a goccia.
Posizionare il tubo dall'uscita del generatore di goccioline all'interno di un tubo PCR da 0,5 millilitri e regolare la portata della pompa della siringa a due microlitri al minuto, per consentire alle dimensioni della goccia di stabilizzarsi prima di raccogliere l'emulsione risultante. Raccogliere lentamente e con cura l'emulsione dalla parte superiore del tubo e trasferire 75 microlitri della soluzione in un tubo PCR da 200 microlitri per il ciclo termico. Quindi, confermare che il contenuto di olio nel tubo PCR corrisponde strettamente al volume della fase dispersa, per evitare coalescenza delle goccioline durante il ciclo termico e posizionare il tubo da 200 microliter nel ciclore termico.
Per l'imaging a fluorescenza del campione emulsionato, trasferire l'emulsione PCR in un tubo capillare borosilicato profondo 50 micrometri con un profilo rettangolare, per consentire la disposizione delle goccioline in un monostrato chiuso imballato per l'imaging. Dopo aver riparato e sigillato i capillari su uno scivolo del microscopio, caricare lo scivolo sullo stadio del microscopio invertito. E nel software di imaging al microscopio, selezionare acquisire e vivere velocemente, per avviare l'acquisizione della fotocamera in tempo reale.
Quindi, osservare il campione sotto campo luminoso e microscopia a fluorescenza. Dopo la generazione di goccioline e il ciclo termico, le goccioline possono essere introdotte in un capillare di vetro con una larghezza di un millimetro e un'altezza di 50 micrometri. Per ottenere una distribuzione monostrato delle goccioline ideale per l'acquisizione di immagini a fluorescenza, le immagini possono quindi essere registrate per ogni lunghezza d'onda.
Dopo l'analisi delle immagini, l'intensità di fluorescenza di tutte le goccioline nei rispettivi fluorofori può essere tracciata per stabilire la soglia delle goccioline positive e negative. Dopo l'identificazione e il conteggio, è possibile calcolare le copie per valori di goccioline e determinare la percentuale di cellule CD3+T e cd4+25+ cellule T regolatorie in base rispettivamente alle copie metilate cd3Z e FOXP3, rispetto alle copie per goccia delle cellule totali o del gene C-less. I valori percentuali possono quindi essere confrontati con quelli ottenuti attraverso l'imaging ad immunofluorescenza utilizzando gli anticorpi appropriati.
Penso che la stabilità dell'emulsione dalla generazione di goccioline attraverso il ciclo termico e le fasi finali di imaging delle goccioline sia fondamentale per ottenere risultati di quantificazione precisi, affidabili e riproducibili. La personalizzazione md PCR attraverso una formulazione di mix PCR su misura può essere utilizzata per una serie di applicazioni tra cui la ricerca sul cancro, la diagnosi delle malattie infettive e l'analisi a livello di singola cellula.
