Questo protocollo può essere utilizzato per misurare con precisione il numero di copie del DNA mitocondriale presenti nelle singole cellule e il livello di alcuni tipi di mutazione del DNA mitocondriale. I metodi precedenti possono effettuare con precisione queste misurazioni in campioni di tessuto contenenti molte cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo effettuare le stesse misurazioni in singole cellule.
Questo metodo è particolarmente utile per coloro che studiano i mitocondri e avrà ampie applicazioni in questo campo. L'isolamento e la lisi efficaci delle singole cellule sono fondamentali per questa tecnica. L'esperienza precedente con l'ordinamento a cella singola sarebbe molto utile.
Per iniziare, preparare il master mix per la PCR senza il DNA campione su ghiaccio, come descritto nel testo. Dopo il vortice brevemente, distribuire il volume richiesto della miscela master preparata a ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti di generazione di gocce, disponendo i campioni in colonne piene. Quindi, aggiungere la combinazione principale a qualsiasi pozzo vuoto in colonne incomplete per utilizzarle come controlli non modello.
Quindi aggiungere il DNA di input a ciascun pozzetto per rendere il volume totale di ciascun pozzetto di 22 microlitri. Sigillare la piastra con una guarnizione adesiva e posizionarla su uno shaker a 2000 RPM per un minuto. Quindi centrifugare la piastra a 1000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius prima di metterla sul ghiaccio.
Per la generazione di gocce, assicurarsi innanzitutto che il generatore di goccioline sia acceso e controllare se una bottiglia di olio che genera goccioline è caricata nella posizione E del ponte strumenti. Quindi fare clic su Configura piastra campione sul touchscreen. Dopo aver selezionato tutte le colonne sulla piastra campione contenente i campioni o gli spazi vuoti, fare clic su OK per confermare la configurazione della piastra.
Quindi, caricare le cartucce del generatore di gocce nella posizione B sul ponte strumenti in modo che tutte le luci diventino verdi e posizionare un trogolo di scarico vuoto nella posizione C.Quindi caricare le scatole di punta del filtro con i coperchi rimossi nella posizione D sul palco dello strumento in modo che tutte le luci diventino verdi. Quindi, rimuovere il sigillo adesivo prima di caricare la piastra campione nella posizione F del piano strumenti in modo che la luce diventi verde. Caricare anche una piastra vuota di raccolta di gocce a 96 pozzetti posta in un blocco freddo, pre-raffreddata a meno 20 gradi Celsius, nella posizione G in modo che la luce diventi verde.
Fare clic su Start Droplet Generation (Avvia generazione di gocce) sul touch screen dello strumento e il coperchio del generatore di gocce si chiuderà automaticamente. Una volta completata la generazione delle gocce, controllare visivamente la piastra di raccolta del campione per confermare che uno strato di emulsione di gocce sia presente sopra la fase oleosa in ciascun pozzetto. Quindi, accendere il sigillatore a piastre e impostare la temperatura su 180 gradi Celsius e sigillare il tempo a cinque secondi.
Consentire alla macchina di raggiungere la temperatura di esercizio. Quindi posizionare la piastra di raccolta del campione sul supporto della piastra del sigillante e posizionare un nuovo sigillo di alluminio sulla parte superiore della piastra con la linea rossa rivolta verso l'alto. Quando la sigillatrice di piastre ha raggiunto la temperatura di esercizio, premere Eject sul touch screen dello strumento.
Dopo aver posizionato il portapiastre nel cassetto del sigillatore di piastre, premere il sigillo per chiudere il cassetto. Una volta completata la sigillatura, il cassetto si aprirà automaticamente. Rimuovere la piastra sigillata e posizionarla sul blocco freddo.
Quindi spegnere il sigillante a piastre. Per eseguire la PCR, posizionare la piastra di raccolta delle gocce sigillata in una macchina PCR con un blocco di 96 pozzetti profondi. Al termine della PCR, accendere il lettore di gocce e il computer collegato.
Caricare la piastra con i campioni post-PCR nel supporto della piastra del lettore di gocce. Mantenendo il coperchio della pellicola sulla piastra del campione, posizionare il coperchio sulla parte superiore del supporto e fissarlo in posizione con clip di bloccaggio nere. Quindi, per aprire il coperchio del lettore di gocce, premere il pulsante di apertura / chiusura.
Quindi caricare il supporto della piastra del lettore di gocce con la piastra del campione nella camera del lettore e posizionarlo saldamente sulla base magnetica. Premere nuovamente il pulsante di apertura/chiusura per chiudere il coperchio. Aprire l'interfaccia del software di analisi.
Selezionare la scheda Aggiungi piastra, fare clic su Aggiungi piastra e quindi su Configura piastra. Nella scheda Informazioni piastra, immettere un nome di targa, selezionare Supermix for Probes, No DUTP dal menu a discesa Supermix e immettere un nome file in Save Data File As.In scheda Selezione pozzi, evidenziare i pozzetti da analizzare e fare clic su Includi pozzi selezionati. Quindi, nella scheda Informazioni pozzo, selezionare i pozzi da annotare.
Selezionare Quantificazione diretta dal menu a discesa Tipo di esperimento. Popolare quindi le caselle Descrizione esempio, Tipo di campione e Nome di destinazione e aggiungere note di pozzo e/o note di targa in base alle esigenze. Quindi fare clic su Applica.
Una volta completata la configurazione della piastra, fare clic su Avvia corsa. Per l'analisi dei risultati, selezionare la scheda Analisi dati e aprire il file da analizzare dal menu File di dati personali. Quindi fate clic sulla scheda Ampiezza 1D per gli esperimenti a colore singolo o sulla scheda Ampiezza 2D per gli esperimenti a due colori.
Quindi, selezionare i pozzi che richiedono la soglia. Usate lo strumento Modalità linea soglia per applicare manualmente la soglia nello spazio libero tra le popolazioni positiva e negativa sul grafico di ampiezza, assicurandovi che il mirino sia posizionato in modo tale che le quattro popolazioni di goccioline siano chiaramente separate. Una volta applicata la soglia per tutti i campioni, esportare i risultati come file CSV per ulteriori analisi facendo clic sulla scheda Tabella dati, Importa/Esporta, e selezionando Esporta dati visibili in CSV.
Immettere un nome file adatto e fare clic su Salva. Le procedure di PCR e di lettura delle goccioline utilizzate in questo protocollo hanno dimostrato la presenza di popolazioni chiaramente separate di goccioline positive e negative, sia nei canali fam che esadecimali. Le popolazioni di DNA mitocondriale positive per entrambe le sonde potrebbero anche essere distinte dai lisati monocellulari.
Questo metodo ha anche mostrato che per i campioni con delezioni nel DNA mitocondriale, è presente una popolazione mista di goccioline doppie positive e goccioline positive solo per la porzione non eliminata del DNA. Questo metodo è stato utilizzato con successo per contare il numero di copie del DNA mitocondriale per cellula in una varietà di cellule di mammifero, compresi gli ovociti di topo e le cellule embrionali primarie di topo. Inoltre, nelle cellule con eteroplasmia ad alta delezioni, la popolazione positiva per una singola sonda è risultata significativamente più grande della popolazione doppiamente positiva.
Tuttavia, nelle cellule con eteroplasmia a bassa delezioni, entrambe le popolazioni erano di dimensioni simili. Quindi risultati accurati assicurano sempre che la generazione di goccioline abbia avuto successo e che la soglia sia stata applicata in modo appropriato utilizzando la vista di ampiezza 1D o 2D. Il lisato inutilizzato può essere utilizzato per altri saggi a singola cellula, come il pirosequenziamento, che può misurare l'eteroplasmia del polimorfismo a singolo nucleotide.
Lo sviluppo di questa tecnica ci ha permesso di effettuare misurazioni accurate del numero di copie del DNA mitocondriale e dell'eteroplasmia da delezione nelle singole cellule, cosa che in precedenza non era possibile.
