Con questo metodo, possiamo studiare gli effetti dell'attività intrinseca sulla maturazione dei precursori corticali interneuroni. Questa tecnica fornisce un modo efficiente per mirare e manipolare le proprietà cellulari dei progenitori corticali interneuron che è accessibile alla maggior parte della comunità scientifica. Questo protocollo prevede la gestione meticolosa di campioni e attrezzature e può essere apprezzato al meglio dalla dimostrazione visiva.
Utilizzando una penna impermeabile, disegnare una linea retta attraverso il centro della parte inferiore della superficie inferiore di sei piastre di Petri da 35 millimetri. Aggiungere 10 millilitri di agarosio gelificante liquido basso al 4% in PBS in due delle piastre di Petri da 35 millimetri e incorporare da tre a quattro cervelli sezionati nell'agarosio con i bulbi olfattivi rivolti verso il basso per piatto attraverso la linea retta, lasciando da tre a cinque millimetri di spazio tra ogni campione. Quando tutto il cervello è stato incorporato, posizionare i piatti a quattro gradi Celsius per consentire all'agarosio di solidificare e intagliare i tre cervelli in un singolo blocco di agarosio, lasciando circa tre millimetri di gel intorno ai bordi dei campioni.
Incollare il blocco sulla superficie di una base di microtomo e utilizzare una lama chirurgica per tagliare fino in fondo al blocco tra ogni campione di tessuto per ottenere tre blocchi indipendenti. Successivamente, utilizzare un microtomo a lama vibrante per sezionare i blocchi nella soluzione Krebs ghiacciata in fette spesse 250 micrometri, utilizzando una microspacola piatta piegata per raccogliere solo le fette contenenti le eminenze ganglioniche mediali o caudali. Quindi, posizionare ogni sezione su singole membrane filtranti di 13 micrometri di diametro, di dimensioni dei pori di otto micrometri che galleggiano su un mezzo essenziale minimo nei singoli piatti di coltura dell'organo del centro di polistirolo.
Una volta ottenute tutte le sezioni, posizionare i piatti in un incubatore di coltura tissutale di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora. Prima dell'iniezione focale di DNA, posizionare colonne di agarosio lunghe 10 millimetri perforate con una pipetta di vetro lunga 225 millimetri e di capacità di due millilitri in una soluzione Krebs ghiacciata. Utilizzando una lama chirurgica, tagliare un pezzo più piccolo di agarosio per adattarsi alla superficie dell'elettrodo di elettroporazione e un pezzo più grande da utilizzare come base per le iniezioni focali di DNA.
Quindi, posizionare i blocchi di agarosio nella soluzione Krebs ghiacciata. Per l'iniezione, mescolare l'espressione e controllare il DNA vettoriale a una concentrazione di un microgrammo per microlitro per ogni vettore e aggiungere una soluzione di stock verde veloce a una diluizione da uno a 10. Riempire una micropipetta di vetro di diametro esterno tirata di 0,5 millimetri, diametro esterno di un millilitro con 10 microlitri della miscela di DNA e caricare la micropipetta in un iniettore PicoPump pneumatico.
Posizionare il blocco più grande di agarosio al microscopio stereo e posizionare la fetta da iniettare sul pezzo di agarosio. Quindi, iniettare da 25 a 50 volumi di nanolitri nella regione di eminenza ganglionica mediale o caudale selezionata della fetta. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il piccolo blocco di agarosio sull'elettrodo della piastra di Petri e utilizzare una microspacola a terminazione piatta per attaccare la colonna di agarosio all'elettrodo di copertura mobile.
Trasferire la fetta iniettata con la sua membrana di supporto sul blocco di agarosio e posizionare l'elettrodo superiore con la colonna di agarosio sopra la regione selezionata della fetta. Quindi, elettroporate la regione con due impulsi di cinque millisecondi di 125 volt, distanti 500 millisecondi l'uno dall'altro. Dopo l'elettroporazione, riposizionare la fetta con la sua membrana portante nel suo piatto di tenuta e riportare il piatto all'incubatore di coltura tissutale.
Dopo un'ora, sostituire il mezzo essenziale minimo con un mezzo di base appropriato per le colture neuronali primarie e riportare le fette all'incubatrice durante la notte. In questi esperimenti di elettroporazione, circa il 50% dei neuroni positivi della GFP ha co-espresso la proteina iniettata positiva RFP e quindi, la popolazione negativa rfp positiva del GFP è servita come controllo interno per l'effetto dei ligandi del DNA iniettati. La somministrazione di clozapina e ossido aumenta selettivamente l'attività delle cellule positive rfp trasfette, come dimostrato dall'espressione della proteina dipendente dall'attività, c-Fos, in queste sezioni di tessuto coronale appena neonato.
Il trattamento con clozapina e ossido si traduce anche in un aumento della percentuale di cellule positive alla GFP rfp rispetto al numero di cellule RFP negative positive alla GFP rispetto ai littermate somministrati dal veicolo. Questa procedura può essere utilizzata per studiare gli effetti degli internauri innestati modulati dall'attività sulla plasticità circolatoria e sulla funzione cerebrale dell'ospite.
