Questo approccio consente di studiare l'identità cellulare, l'integrazione e la funzionalità degli interneuroni trapiantati per un tempo prolungato nello sviluppo di cervelli sani e malati. Il protocollo descrive una generazione rapida e altamente efficiente di interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane come precursori che sopravvivono e maturano nell'ippocampo di topi ingenui e transgenici. Questo approccio ci aiuta a valutare il potenziale terapeutico dell'uso della terapia cellulare nei disturbi dello sviluppo in cui gli interneuroni sono compromessi.
Per iniziare, rimuovere il terreno di coltura cellulare dai precursori dell'interneurone di origine umana e risciacquare accuratamente con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 400 microlitri della soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Incubare per due o tre minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore fino a quando il bordo delle cellule inizia a sembrare lucido.
Quindi, aggiungere 600 microlitri di terreno N2 fresco a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti per fermare la soluzione di distacco della cella e staccare meccanicamente le celle utilizzando una pipetta per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di plastica e centrifugare a 180 G per quattro minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto e risospendere il pellet nel mezzo di trapianto.
Contare le celle totali nella sospensione utilizzando una camera di conteggio e un contatore di conteggio e regolare il volume a una concentrazione finale di 100.000 cellule per microlitro. Tenere la sospensione cellulare in un tubo chiuso sul ghiaccio fino al trapianto per un massimo di quattro ore. Immediatamente dopo l'anestesia, posizionare il cucciolo su un tessuto bagnato sulla superficie del ghiaccio bagnato per tre minuti fino a quando gli arti superiori diventano biancastri.
Risospendere le celle con cautela con la pipetta e caricare la siringa con la sospensione cellulare. Posiziona il cucciolo posizionandolo sul telaio stereotassico e usando le barre auricolari nella direzione opposta. Quindi, pulire la superficie della pelle usando un tessuto molle imbevuto di etanolo.
Identificare lambda e impostare le coordinate su zero sulla console di visualizzazione digitale dello strumento stereotassico. Dopo aver spostato la siringa di Hamilton alle coordinate desiderate, utilizzare un ago da insulina piegato a 90 gradi per penetrare nel cranio, creando un piccolo foro. Quindi, portare la siringa di Hamilton verso il basso fino a quando l'ago attraversa il cranio e azzerare la coordinata dorsoventrale.
Abbassare l'ago fino a raggiungere le coordinate dorsoventrali desiderate. Ritrarre lentamente l'ago una volta iniettate le cellule staminali. Termina la procedura riscaldando il cucciolo con le mani fino a quando non inizia a muoversi prima di restituirlo alla madre.
Nessuna reazione immunitaria o infiammazione locale contro le cellule trapiantate è stata riscontrata né al giorno postnatale 14 né due mesi dopo il trapianto, come valutato dall'assenza di microglia reattiva identificata utilizzando Iba1, CD68 e galectina-3. L'estensione dell'astrogliosi è determinata dalla proteina acida fibrillare gliale e dalle citochine infiammatorie, come l'interleuchina-1, e dall'assenza di linfociti citotossici. Nei topi knock-out Cntnap2, le cellule simili a interneuroni derivate da cellule staminali umane sono sopravvissute fino a nove mesi dopo il trapianto e sono state localizzate nel sito di iniezione.
Tuttavia, erano anche dispersi attraverso l'ippocampo omolaterale e persino controlaterale, come osservato nei topi wild-type. Il protocollo richiede pratica per garantire la minima interruzione e compressione del cervello, oltre a mantenere un buon equilibrio tra la velocità della procedura e la precisione delle coordinate. Questo protocollo è compatibile con una serie di tecniche, come studi di connettività o letture funzionali come l'elettrofisiologia o studi comportamentali, a seconda della ricerca, domanda di interesse.
