Questo protocollo ci consente di rispondere a una varietà di domande sul modo in cui il taglio agisce sulle cellule in soluzione e fornisce un controllo significativo sulla durata e l'entità del taglio. A differenza di altre tecniche, che rilevano l'effetto del taglio sulle cellule immobilizzate, questa tecnica ci consente di applicare il taglio alle cellule in soluzione e si presta a uno spettro di metodi di rilevamento del segnale a valle. Dopo aver ottenuto sangue periferico da un donatore adulto sano e consenzioso in un tubo da 4,5 millilitri di citrato trisodico al 3,8%, centrifugare il sangue per ottenere plasma ricco di piastrine e utilizzare una punta di pipetta tagliata con un angolo di 45 gradi per rimuovere con cura lo strato plasmatico superiore, torbido e giallo ricco di piastrine risultante.
Ottenere il conteggio piastrinica tramite l'ettaro completo e regolare il conteggio delle piastrine a circa 2,5 volte 10 alla quinta piastrine per microlitro con plasma a base di piastrine umane in pool. Quindi, posizionare la sospensione a 22 gradi Celsius con una rotazione delicata. Per il trattamento del ligando, aggiungere lentamente l'anticorpo o il ligando di interesse al plasma ricco di piastrine e mescolare delicatamente le piastrine.
Durante l'incubazione, accendere il viscometer a cono e impostare la temperatura della piastra a 22 gradi Celsius. Dopo cinque o 10 minuti, trasferire il plasma trattato ricco di piastrine sul viscometer a cono controllato a temperatura direttamente al centro della piastra, facendo attenzione che tutto il campione sia depositato tra il cono e la piastra nel punto di contatto. Per applicare la cesoia al campione, calcolare la cesoia in base al manuale viscometer e applicare la cesoia al campione alla velocità e alla durata appropriate.
Al termine dell'applicazione, sollevare il cono a circa due millimetri dalla piastra, in modo che il campione rimanga a contatto sia con la piastra che con il cono, e utilizzare una punta della pipetta a caricamento in gel per raccogliere da cinque a 10 microlitri dal centro del volume del campione. Quindi incubare il campione tranciato con anticorpi contro i marcatori superficiali di interesse per 20 minuti a temperatura ambiente e fissare i campioni in paraformaldeide al 2% per 20 minuti a temperatura ambiente. Per analizzare i campioni per citometria di flusso, raccogliere almeno 20.000 eventi per ogni condizione e quantificare la potenza del segnale di ogni marcatore fluorescente, utilizzando il valore di altezza per l'intensità di ogni fluoroforo.
Quindi utilizzare un controllo negativo con albumina di siero bovino o veicolo per disegnare un cancello, esclusi gli eventi fluorescenti di sfondo negativi, e quantificare la percentuale di eventi all'interno del cancello per tutte le condizioni sperimentali. L'espressione del marcatore di attivazione piastrinica in risposta all'applicazione della forza di taglio non è regolamentata in modo dipendente dal tempo. Qui vengono mostrate letture rappresentative dell'attivazione piastrinica umana in presenza di due anticorpi mirati al dominio N-terminale della glicoproteina 1b-IX e di un anticorpo di controllo in condizioni tranciate e statiche.
L'espressione di tutti e tre i marcatori di attivazione è stata significativamente aumentata in presenza di forze di taglio e anticorpi mirati, rispetto alle condizioni statiche o in presenza di anticorpi di controllo. In particolare, il trattamento con anticorpi con una forza non vincolante troppo bassa per innescare l'attivazione della glicoproteina 1b-IX non innesca l'upregolazione del marcatore di attivazione piastrinica in condizioni statiche o di forza di taglio. Inoltre, il plasma proveniente da pazienti con trombocitopenia immunitaria contenente anticorpi contro la glicoproteina 1b-IX innesca risposte dipendenti dal taglio in contrasto con il plasma da pazienti senza glicoproteina 1b-IX che prendono di mira anticorpi.
Oltre alle analisi flowcitometriche, le cellule che sono state esposte al taglio possono anche essere lese per l'analisi western blot, ELISA e mass-spec per determinare eventuali cambiamenti nel livello proteico. Come sempre, quando si utilizzano campioni di sangue o umani, assicurarsi di indossare dispositivi di protezione adeguati e seguire le linee guida sulla sicurezza del laboratorio e sugli agenti patogeni nati dal sangue del tuo istituto.
