Lo scopo di questa ricerca è valutare la funzione piastrinica in condizioni fisiologiche. Studiamo in modo specifico la funzione piastrinica utilizzando dispositivi microfluidici e superfici biologiche. E utilizzando questo approccio, siamo stati in grado di rispondere a domande relative alla disfunzione piastrinica e alla rianimazione emostatica per applicazioni nella medicina trasfusionale.
Gli attuali saggi di funzionalità piastrinica spesso testano la capacità delle piastrine di aggregarsi in risposta a uno specifico agonista di scelta. I metodi di rilevamento possono includere la trasmissione della luce o l'impedenza elettrica e questi saggi possono utilizzare campioni di processo e vengono testati in modo stagnante. Utilizzando questo approccio microfluidico per testare la funzione piastrinica, incorporiamo la fluidodinamica per aggiungere rilevanza fisiologica.
La fluidodinamica svolge un ruolo critico nei meccanismi biologici coinvolti nella funzione piastrinica durante l'emostasi. Nei pazienti sanguinanti, siamo particolarmente preoccupati per la funzione piastrinica e per gli interventi terapeutici che possono migliorare tale funzione per ottenere risultati migliori. Utilizzando questo approccio di test della funzionalità piastrinica, siamo in grado di monitorare i contributi di diverse popolazioni piastriniche in un esperimento e sbloccare un modo per valutare le opzioni terapeutiche per traumi e altre condizioni emorragiche.
Per iniziare, versare la base in elastomero siliconico in un piatto di pesata. Aggiungere l'agente indurente siliconico in un rapporto di dieci a uno e mescolare accuratamente la miscela per garantire una corretta reticolazione delle catene del polimero siliconico. Posizionare lo stampo master in una capsula di Petri e versare uniformemente il PDMS non polimerizzato sullo stampo.
Quindi, posizionare la capsula di Petri all'interno di un essiccatore sottovuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle dal composto. Per terminare l'indurimento del PDMS, posizionare lo stampo in un forno impostato a 70 gradi Celsius per 90 minuti. Dopo l'indurimento completo del PDMS, utilizzare una lama di rasoio o un bisturi per ritagliare il calco microfluidico.
Praticare dei fori ai bordi dei canali. Ora, posiziona il vetrino e il calco microfluidico con il lato inciso verso l'alto in un pulitore al plasma. Avviare la pompa del vuoto e sigillare la camera.
Quindi, portare il pulitore al plasma sull'impostazione Alta e lasciare l'impostazione nell'aspirapolvere per 30 secondi. Successivamente, spegnere il pulitore al plasma e rilasciare l'aspirapolvere. Per legare il cast pulito al plasma e il vetrino, premere delicatamente insieme i lati rivolti verso l'alto nel pulitore al plasma.
Posizionare il dispositivo microfluidico in un forno o su una piastra calda a 70 gradi Celsius per 10 minuti per finalizzare il processo di legatura. Ora, rivestire la camera microfluidica con il reagente di collagene fibrillare equino di tipo uno attraverso un'uscita designata all'ingresso designato. Conservare il dispositivo in un contenitore caldo, umido e chiuso per evitare che il collagene rivestito evapori all'interno del canale.
Dopo un'ora, sciacquare il dispositivo con PBS nella direzione opposta al rivestimento per eliminare la soluzione di collagene. Per iniziare, incubare il sangue intero citrato con un anticorpo CD41 coniugato a fluorescenza, utilizzando un fluoroforo a scelta. Macchiare il sangue per 30 minuti su un dondolo nutante.
Quindi, accendere il microscopio e il software associato. Impostare il livello della pompa a siringa di prelievo con il tavolino del microscopio e regolare le impostazioni della pompa a siringa in base ai requisiti sperimentali. Quindi, posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio e fissarne i bordi con del nastro adesivo al tavolino per impedirne il movimento.
Ora, collegare il tubo del diametro interno di un sedicesimo di pollice a un connettore a gomito, quindi a una siringa da 10 millilitri con un connettore del diametro interno di un sedicesimo di pollice. Riempire la siringa da 10 millilitri con PBS sterile e collegarla alla pompa a siringa. Quindi, inserire il connettore a gomito nell'uscita del dispositivo microfluidico.
Preparare linee di ingresso lunghe circa 10 centimetri con un connettore a gomito su un'estremità e un taglio angolato sull'altra estremità. A questo punto, collegare il connettore a gomito di ingresso all'ingresso del dispositivo e posizionare la linea di ingresso in una provetta per microcentrifuga di scarto posizionata su un supporto angolato. Utilizzare la lente dell'obiettivo 10 volte per mettere a fuoco i bordi del canale del dispositivo microfluidico.
Quindi, prepara le linee con PBS. Far avanzare manualmente la pompa a siringa per liberare il canale da PDMS o detriti. Controllare vicino all'ingresso e all'uscita del canale per eventuali ostruzioni.
A questo punto, aprire le impostazioni di acquisizione delle immagini salvate o creare una nuova procedura di acquisizione delle immagini per le serie temporali acquisite ogni uno o due secondi con un canale di campo chiaro e canali fluorescenti corrispondenti agli anticorpi CD41 nel campione di sangue. Ottenere il campione di sangue citrato filtrato e mescolarlo pipettandolo su e giù appena prima di iniziare l'esperimento. Posizionare il campione sul supporto angolato per microcentrifuga.
Quindi, posizionare la linea di ingresso nel campione di sangue e iniziare a registrare l'acquisizione dell'immagine. Estrarre lentamente la siringa per riempire il volume morto nel tubo. Una volta che il sangue raggiunge il canale, premere immediatamente Play sulla pompa a siringa per riprendere il flusso alla velocità desiderata.
Eseguire l'esperimento fino a quando le piastrine non hanno completamente occluso la regione stenotica del dispositivo microfluidico, o fino al punto finale dell'esperimento, che in genere è di 10 minuti. Una volta completato l'esperimento, interrompere l'acquisizione dell'immagine e arrestare la pompa a siringa. Infine, salva l'acquisizione dell'immagine nella memoria appropriata.
