L'agente trypanosoma cruzi della malattia di Chagas può produrre infezioni sintomatiche di lunga durata che possono aprirsi alla patologia clinica riconosciuta. Il ritrovamento del Trypanosoma cruzi nidifica nel tubo seminifero di un ragazzo morto di malattia di Chagas suggerisce il protocollo di ricerca per svelare la possibile trasmissione sessuale dei parassiti Chagas. Fornire assistenza sanitaria per un periodo di cinque anni e reclutare le famiglie, mostrando i partecipanti con sintomi clinici della malattia acuta di Chagas, ACG.
Ottenuto 15 ml di sangue venoso dei partecipanti alla famiglia in tre occasioni a un anno di distanza l'una dall'altra, divise in tre, cinque milioni di aliquote e conservare a quattro gradi centigradi. Raccolti due ml dell'eiaculato siero da volontari adulti mostrano il T.cruzi nel sangue dei casi di ACG per convalidare i test molecolari. Isolare il T.cruzi dall'aliquota del sangue ACG viene conservato in un tubo sterile da 10 ml con anticoagulante.
Inoculare cinque ml del sangue in 50 ml di inclinazione del tubo più cinque ml di mezzo triptosio per infusione epatica e incubare in uno shaker a 27 centigradi per tre mesi. Microscopia di ricerca per il T.cruzi in 100 microliter del supernatante sullo scivolo di vetro. Raccogliere i flagellati dal mezzo centrifugato a 1.000 x G per 10 minuti e lavati in PBS pH 7.4.
Inoculare 75 ml L6 muscolo cell culture pallone ciascuno con 10 al sesto T.cruzi isolati. Nutrire le cellule di coltura con 15 ml di Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM a 37 centigradi. Far crescere il parassita isola e il controllo positivo Berenice T.cruzi.
Far crescere la relativa T.cruzi Leishmania braziliensis in DMEM come controllo negativo. Utilizzare 10 x 10 alla sesta coltura tissutale derivata T.cruzi trypomastigotes per infettare i topi. Cerca i nidi del T.cruzi nelle sezioni dei muscoli e degli organi di riproduzione dopo un mese.
Utilizzare le aliquote del sangue nel tubo sterile EDTA Corning da 10 ml e raccogliere i globuli bianchi per centrifugazione gradiente di densità a 3.000 x G per 45 min. Lavare le celle due volte con PBS e centrifugare a 1.500 x G per 10 minuti in un tubo diverso. Estrarre il Dna dall'isolato inviato dal Berenice T.cruzi da L.braziliensis da 109 soggetti della famiglia e dagli spermatozoi da 21 partecipanti come nella fase 3.3 del protocollo.
Misurare le concentrazioni di DNA sullo 0,8% di gel di agarosio e assorbito a 206 nanometri. Utilizzare il T.cruzi TCZ un trattino due primer ricotto alla sonda nucleotidica 188 nell'analisi PCR. Crea il mix PCR con DNA modello da 10 nanogrammi, 0,4 micromolare di ogni coppia di primer, due unità di DNA polimerasi stock, 0,2 DNA-TP micromolare e 5 cloruro di magnesio micromolare in un volume finale di 25 microlitri.
Condurre l'amplificazione del DNA come nel passaggio 3.5.2 e mostrare le bande di DNA nel gel. Utilizzare le ricottura della sonda nucleotidica T.cruzi 188 fino ad oggi etichetta primer con alpha 32P dATP e separare il prodotto PCR su un gel di agarosio dell'1,3% e trasferirlo su una membrana di nylon caricata positivamente. Lavare la membrana e ora esporre al campo dei raggi X per periodi variabili.
Far crescere i cloni selezionati dal campo dei raggi X e sequenziare commercialmente con il TCZ un trattino due primer. Condurre tre saggi indipendenti di immunofluorescenza e triplicare una o 100 diluizioni siere in PBS da 109 partecipanti allo studio. Centrifugare l'aliquota di cinque ml del sangue chiuso a 1.000 x G per 30 minuti e conservare il siero a meno 20 centigradi.
Eseguire diluizioni indipendenti del siero di immunofluorescenza dai campioni di studio ottenuti in tre occasioni a un anno di distanza l'una dall'altra. Utilizzare 5 microliter delle amastigoti T.cruzi formalmente incubate o promastigoti L.braziliensis, 10 parassiti per microlitro nelle sospensioni PBS su scivolo di vetro e lasciarlo asciugare durante la notte, come nella fase 5.3.3. Incubare il parassita sul vetro con 100 microlitri di diluizioni siere da uno a 100 e coprire con scivolare in una camera umida per un'ora a 37 centigradi, quindi lavare due volte con PBS.
Incubare gli scivoli di vetro essiccati all'aria con una o 1.000 diluizione di un anticorpo di coniglio etichettato fluoresceina contro igG umano, lavare e asciugare pure. Montare lo scivolo di vetro con uno scivolo di copertura ed esaminarlo al microscopio a luce UV. Rilevare il T.cruzi e l'antigene solubile L.braziliensis un microgrammo in 100 microliter di tampone di carbonato pH 9.6.
Incubare con 100 microliter della diluizione da uno a 100 sieri in pozzi trilicati squartati. Lavare le piastre due volte con soluzioni PBS-Tween e attendere l'asciugatura. Incubare con 100 microliter da uno a 1.000 diluizioni di coniugato fosfatasi alcalina, capra anti-coniglio IgG.
Lavare le piastre due volte con PBS-Tween, aggiungere il substrato para-nitrofenilfosato e attendere lo sviluppo del colore. Leggere le densità ottiche a 630 nanometri in un lettore di lastre multimobile. Transilluminare le uova di gallina fertili e fare un buco nel guscio alla loro bolla.
Inoculare 100 trypomastigoti su ogni mezzo di coltura del guscio nelle uova di controllo fittizie. Sigillare il foro con nastro adesivo. Incubare le uova a 37 centigradi, il 65% di umidità per 21 giorni.
Coltiva i pulcini nati dal gruppo di uova di controllo vivo A dai finti controlli, dal gruppo B e dalle uova inoculate T.cruzi, gruppo C fino alla loro vita adulta. Sfida i polli del gruppo B e C due volte con 10 x 10 alla settima tripomastigote formalmente incubata settimanalmente. Ottenere due ml di sangue venoso da una vena alare dei polli A, B e C cinque settimane dopo la sfida.
Separare il siero ed eseguire l'analizzatore di immunofluorescenza per rilevare l'anticorpo T.cruzi. Benessere sicuro degli animali con alloggi eccellenti, cibo e approvvigionamento idrico. Utilizzare l'eiaculato dello sperma da un adulto e un caso di malattia di Chagas positivo all'APCR e da un soggetto di controllo come nel passaggio 1.5 del protocollo.
Infondere 100 aliquote microliter di sperma nel peritoneale e nella vagina dei topi. La trasmissione sessuale dell'infezione da T.cruzi nei topi parentali e progenie. L'impronta del Trypanosoma cruzi dalla malattia acuta di Chagas mostrata dai prodotti nDNA-PCR che si formano in anticipo con la sonda radio etichettata.
Il fenotipo del T.cruzi rivelato con il saggio di immunofluorescenza. L'anti-T. l'anticorpo cruzi non riconosce L.braziliensis.
Rappresentazione grafica dell'ELISA e dei saggi nDNA-PCR. Gruppi uno e due rispettivamente, controllo negativo e positivo. Gruppo tre, nDNA-PCR positivo e test anticorpali specifici.
Gruppo quattro con le infezioni T.cruzi rilevate dalla nDNA-PCR ma in assenza dell'anticorpo specifico. Gruppo cinque, partecipanti senza infezione. Gli eredogrammi e la mappatura della popolazione familiare mostravano discrepanze tra i rapporti dell'anti-T.
anticorpi cruzi e quelli dei test nDNA-PCR. Aperto è quadrato e cerchio, negativo maschio e femmina. Rosso con anti-T.
anticorpo cruzi e nDNA-PCR positivo. Nero, positivo nDNA-PCR da solo. La tolleranza immunitaria nei polli nati da uova inoculate T.cruzi.
Un finto controllo, B, polli vivi controllati sfidati con l'antigene T.cruzi. C, i polli nati dalle uova inoculate T.cruzi dopo la sfida con l'antigene specifico. L'infettività del T.cruzi mostrò sugli instillati di sperma nella cavità peritoneale e nella vagina.
I topi hanno sacrificato tre settimane di questi alai mostravano il nido di amastigoti nel cuore, nel muscolo scheletrico e nei deferenti vas e nel tubo uterino. La trasmissione sessuale delle infezioni da T.cruzi nel sistema del modello di topo. I T.cruzi infettano maschi e femmine, trasmettendo l'infezione a compagni ingenui.
L'infezione da T.cruzi si è trasferita verticalmente dal parentale ai topi di progenie. L'assorbimento meridionale ha rivelato la fascia di anginato parassita nella maggior parte delle cucciolate di F1. La macchia immunoperossidasi T.cruzi amastigotes ha mostrato engoniablast e nell'interstiziale dell'epididimite e nel lume dei tubi seminiferi dei topi di progenie.
La dimostrazione parassitologica del protozoo in 21 casi acuti della malattia di Chagas è stata cruciale per convalidare l'impronta T.cruzi in tutti i soggetti infetti. Le discrepanze tra i rapporti tra i test degli anticorpi parassiti e quelli dei test sugli acidi nucleici hanno rivelato la maggior parte delle impronte nei pazienti senza anticorpi. L'ampia differenza ben spiega nel modello di pollo riflessa al T.cruzi dopo la prima settimana di sviluppo dell'embrione.
La tolleranza immunitaria polli adulti ha mostrato le impronte dei parassiti ma con l'assenza dell'anticorpo specifico. L'anti-cruzi vitale negli eiaculi del paziente Chagas ha iniziato infezioni diffuse sugli instilli nella vagina del topo e anche nella cavità peritoneale. La patologia ha mostrato i nidi di amastigote T.cruzi nel cuore e nei muscoli scheletrici e nei deferenti vas e nel tubo uterino.
L'allevamento di topi Chagas con compagni ingenui ha rivelato che le femmine e i maschi infetti hanno trasmesso il T.cruzi ai compagni ingenui non infetti e la maggior parte delle loro cucciolate ha acquisito l'infezione trasferita verticalmente alla progenie. Il protocollo basato sulla famiglia si rivolgeva al dosaggio degli acidi nucleici al fine di eseguire trasfusioni di sangue affidabili e indagini epidemiologiche e chiarire la potenziale malattia di Chagas a trasmissione sessuale in corso.
