Questo protocollo dimostra l'espressione e la purificazione degli anticorpi e il monitoraggio in tempo reale della distribuzione degli anticorpi nel tumore e nei tessuti. Lo screening degli anticorpi con il protocollo descritto aiuterà a selezionare gli anticorpi che hanno una distribuzione limitata dei tessuti non specifica e arricchirà le localizzazioni tumorali. La tecnica descritta è rapida ed economica.
Altre tecniche, come la tomografia computerizzata ad emissione di fotoni singoli e la tomografia ad emissione di positroni, sono molto costose e richiedono traccianti radioattivi e altri traccianti sofisticati. La tecnica non si limita al cancro che prende di mira gli anticorpi. Può essere applicato a qualsiasi altra malattia, come malattie polmonari o cardiache, per l'analisi della distribuzione degli anticorpi nel corpo.
A dimostrare la procedura sarà Jeremy Gatesman, un tecnico veterinario della mia università. Cellule CHO crude in 200 millilitri di media, a Delong, Erlenmeyer fiasche sconcertate. Combina cinque millilitri di supporti freestyle CHO con 50 microgrammi di DNA clone pesante variabile e 75 microgrammi un DNA clone a luce variabile in un tubo da 15 millilitri.
Quindi, vortice il tubo. Lasciare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Aggiungere 750 microlitri di un milligrammo per millilitro di polietilenimina alla soluzione di DNA e vortice aggressivo per 30 secondi.
Lasciare la miscela a temperatura ambiente per altri cinque minuti. Aggiungere l'intera miscela alle cellule CHO scuotendo manualmente il pallone. Incubare immediatamente le cellule a 37 gradi Celsius mentre si trema a 130 giri/min.
Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di agente anti-grumo 100 X e due millilitri di soluzione antimicotica antibatterica 100 X alle cellule. Incubare i contenitori a 32-34 gradi Celsius, con scuotimento a 130 giri/min. Continuare a coltivare le cellule per 10-11 giorni, aggiungendo 10 millilitri di mangime Tryptone N1 e due millilitri di integratore di glutammina 100 X ogni quinto giorno.
Contare le cellule ogni tre giorni per garantire che la vitalità cellulare rimanga superiore all'80%Il giorno 10 o 11, raccogliere il mezzo per la purificazione degli anticorpi centrifugando la coltura a 3000 volte G e quattro gradi Celsius per 40-60 minuti. Quindi, filtrare il supporto chiaro con un filtro bottiglia da 0,22 micrometri. Per purificare gli anticorpi, equilibrare la colonna proteica A con due volumi di colonna di tampone legante.
Passare il supporto filtrato attraverso la colonna alla portata di un millilitro al minuto. Quindi lavare la colonna con due volumi di colonna di buffer di associazione. Utilizzare cinque millilitri di tampone di eluizione per eludere l'anticorpo in 500 frazioni di microlitri.
E neutralizzare il pH dell'anticorpo alluso aggiungendo 10 microlitri di tampone di neutralizzazione per la frazione. Misurare la concentrazione dell'anticorpo purificato con uno spettrofotometro utilizzando il protocollo predefinito per IgG. Dializzare 0,5 millilitri dell'anticorpo utilizzando una cassetta di dialisi in un litro di tampone di coniugazione.
Dopo quattro ore, trasferire la cassetta di dialisi su un tampone fresco e dializzare durante la notte. Per impostare una reazione di coniugazione, aggiungere 0,03 microgrammi di colorante IRR 800 CWU per un milligrammo di anticorpo in un volume totale di 500 microlitri. Incubare la miscela per due ore a 20 gradi Celsius, quindi purificare i coniugati etichettati per dialisi estesa contro PBS.
Stimare il grado di etichettatura misurando l'assorbanza del colorante di 780 nanometri e l'assorbanza della proteina a 280 nanometri. Per sviluppare gli xenografi del topo, sollevare delicatamente la pelle dell'animale e separarla dallo strato muscolare sottostante. Iniettare lentamente 100 microlitri di sospensione cellulare sotto la pelle con un ago calibro 26.
Attendere alcuni secondi prima di eserti l'ago in modo che il mezzo matrice seminterrato informi la struttura semi-solida simile a un gel insieme alle cellule sotto la pelle, il che impedirà alla miscela di uscire dal sito di iniezione. Per eseguire l'imaging in vivo, iniettare l'anticorpo etichettato colorante attraverso la vena della coda. Dopo aver anestetizzato il mouse, verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale e dilatare la vena applicando acqua tiepida.
Utilizzare una siringa per insulina 1cc con un ago calibro 26 per iniettare 25 microgrammi dell'anticorpo etichettato in un volume di 100 microlitri. Come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo isotipo IgG non specifico che non si rivolge alle cellule tumorali. Eseguire l'imaging in vivo otto, 24 e 48 ore dopo le iniezioni di anticorpi.
Nel software di imaging fare clic su inizializza. Verificare che la temperatura dello stadio sia di 37 gradi Celsius. Nel pannello di controllo, impostare l'imaging a fluorescenza attraverso la procedura guidata di imaging e impostare l'eccitazione su 773 nanometri, emissione a 792 nanometri.
Trasferire il mouse anestetizzato nella camera di imaging. Posizionarlo sul campo di imaging usando il cono del naso. Quando è pronto, fare clic su acquisisci nel pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine e fare clic su espone automaticamente.
L'immagine generata è la sovrapposizione della fluorescenza sull'immagine fotografica con fluorescenza ottica e densità visualizzate in unità di conteggi o fotoni. I cloni cDNA positivi con domini variabili pesanti e a luce variabile sono stati confermati con la PCR colonia. I risultati rappresentativi del farletuzumab purificato eseguito sulla pagina SDS non riducente e riducente sono mostrati qui.
Catene pesanti e leggere producevano bande da 50 e 25 kilodalton dopo la riduzione. Confermato anche il legame degli anticorpi con proteine native nella superficie cellulare. Gli anticorpi etichettati fluorescentmente erano iniettati nella vena della coda, in topi innestati con R1 completo che esprimeva tumori.
Gli animali sono stati vissuti immagine in più punti di tempo utilizzando IVIS. i dati confirs arricchimento selettivo di anticorpi completi R1 e BaCa nei tumori. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che il mantenimento delle cellule CHO è fondamentale per la resa degli anticorpi.
Ed è importante avere un grado simile di coniugazione fluorescente del colorante per la localizzazione competitiva del tumore. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'immunoistochimica tissutale e l'ELISA specifica dei tessuti o del tumore possono essere eseguiti per supportare i dati di imaging dei topi vivi.
